היי, אני בן רן, אני פרופסור חבר לכירורגיה והנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת אלבמה, בית הספר לרפואה של ברמינגהאם. המעבדה שלנו מתעניינת בתפקוד ביולוגיה של תאי אנדותל אנגיוגנזה אקוגנזה בהקשר של מחלות לב וכלי דם נפוצות אלה וסרטן. אחד המחקרים שלנו מתמקד בוויסות אפיגנטי ותעתיק של טרנסדיפרנטיזציה של תאי אנדותל ואנגיוגנזה.
כדי להבין את המנגנונים שעתוק של אנגיוגנזה, הקמנו קווי עכבר מהונדסים מהונדסים, שבו יש לנו לא רק נמחק גנים ספציפיים הקשורים אנגיוגנזה בתאי אנדותל, אבל בדיקה GFP משופרת יהיה מתויג גנטית על ריבוזום של תאים אנדותל ילידים. בדרך זו, אנו יכולים לבודד ולטהר לולאות של RNA שליח הקשורים מתאים אנדותל באברי רקמות שונים ישירות בבעלי חיים מהו מהודרים. לאחר מכן נוכל להשתמש ברנ"א השליח המטוהר לניתוח במורד הזרם של תעתיקים ותמלול.
על ידי רצף RNA ו- PCR צונן בזמן אמת. בסרטון זה, התלמידים שלי פטריק מורן וג'ורדן פאלמר וטכנאי המחקר ניקולס ברנקוב ורונג יואן יראה לכם גישה של עכברים מהודקים ושוכם RNA שליח ישירות מן ההיתוך בבעלי החיים מהוססים. Genotyping הוא ראשוני חשוב בפרוטוקול זה כדי להבטיח כי הקרח יש את תג GFP על ריבוזום של תאים אנדותל.
מאז כל צעדי בידוד RNAi במורד הזרם להסתמך על נוכחות של ריבוזום מתויג GFP, זה חיוני כדי לקבוע את הגנוטיפ לפני תחילת הניסוי. לפני תחילת בידוד ה-RNA, יש להשלים מספר צעדי הכנה. אלה כוללים הכנת חיץ וקשירת הנוגדן נגד GFP לחרוזי החלבון G dina.
המאגרים יכולים להימשך עד חודש בארבע מעלות צלזיוס וחרוזי הנוגדן יכולים להימשך עד שבוע בארבע מעלות צלזיוס. אז קח את המגבלות האלה בחשבון בעת תכנון הניסוי שלך. באמצעות homogenizer מונחה תבונה היא דרך מצוינת להגדיל את תפוקת RNA.
הקפד להשתמש בהגדרות ומשך תדר נמוכים יותר כדי להפחית את השפלת ה- RNA. כפי שהוזכר קודם לכן, genotyping הוא צעד ראשוני חשוב בפרוטוקול המשפט. הבטחת כי עכברים אשר RNA הוא להיות מבודד באמצעות טכניקת TRAP הם חיוביים עבור הגן TRAP, לפחות heterozygotes, אבל הומוזיגי באופן אידיאלי עבור הגן TRAP הוא צעד חשוב כי הבטחת תג GFP הוא על ריבוזום הוא חיוני על מנת למשוך למטה באמצעות תגובת נוגדן אנטיגן ואת חמוזי אנטי GFP תוכלו להכין לפני תחילת הניסוי.
לבודד את הרקמות הרצויות מהעכבר ולמקם אותו מיד לתוך PBS קר כקרח עם 100 מיקרוגרם לכל פתרון cyclohexamide מיליליטר. זה מבטיח כי התרגום יופסק כי התמלול יהיה תיאור מדויק של העכבר לפני המתת חסד. השתמש homogenizer מונע מנוע כדי הומוגניזציה הרקמה לתוך השעיית תא.
הגדרות תזמון ותדירות אידיאליות יצטרכו להיקבע על ידי המעבדה הבודדת בהתבסס על homogenizer מונחה מנוע מסוים אתה תהיה משתמש. שימוש בהגדרת תדירות גבוהה מדי עלול להוביל להשפלת RNA ולשבש את שאר הפרוטוקול. להשעות את גלולת התא בתוך מאגר תזה היית צריך להכין לפני תחילת הניסוי.
הקפד הומוגניזציה תערובת זו עוד יותר על מנת להבטיח הומוגניזציה נאותה לפני שתמשיך עם שאר הפרוטוקול. צנטריפוגה הומוגנית במשך 10 דקות ב 2, 000 פעמים G בצנטריפוגה ארבע מעלות צלזיוס. זה יהיה גלולה הגרעינים ופסולת הסלולר גדול אשר עלול להפריע לתגובת immunoprecipitation במורד הזרם.
הוסף שומנים DHPC ו CA-630 אל העל-טבעי מן הצעד הקודם צנטריפוגליזציה. שומנים אלה יסייעו להפריד את שלבי החלבון מהרכיבים תאיים האחרים. מניחים את ההשעיה על קרח במשך חמש דקות ומאפשרים לו לשבת.
צנטריפוגה lysate במשך 10 דקות ב 13, 000 פעמים G כדי גלולה כל חומר מסיס. שמור 15% מהליסייט הברור עבור שלבים עתידיים. מוסיפים את חרוזי הנוגדן נגד GFP לתא lysate supernatant ו דגירה את התערובת בארבע מעלות צלזיוס עם סוף מעל סיבוב סוף במשך 30 דקות.
כאן הנוגדנים נגד GFP יקשרו את הריבוזום המתויג של GFP, ויאפשרו לנו לבודד עוד יותר את ה-RNA מהריבוזום הזה. לאסוף את חרוזים על המדף המגנטי שלך לשטוף את חרוזים חמש פעמים באמצעות מאגר שטיפת פוליקום מלח גבוה שלך כי אתה מוכן לפני תחילת הבידוד. המשך מיד לשלב הבא שבו ת למקם את חרוזים במאגר RLT.
צנטריפוגה lysate במשך שלוש דקות במלוא המהירות בזהירות להסיר את supernatant ולהעביר אותו צינור microfuge חדש. מוסיפים נפח אחד של 70%אתנול ללייט המטוהר ומערבבים מיד על ידי צינורות. המשך מיד לשלב הבא שבו תעביר עד 700 מיקרוליטרים של המדגם, כולל כל משקעים שאולי נוצרו, לעמודת ספין הממוקמת בצינור איסוף של שני מיליליטר.
צנטריפוגה lysate במשך 15 שניות יותר מ 8, 000 פעמים G לשטוף את קרום עמוד ספין. בטל את הזרימה ולהמשיך לשלב הבא. הוסף 350 מיקרוליטרים של מאגר RW1 לעמודת הסיבוב.
צנטריפוגה במשך 15 שניות יותר מ 8, 000 פעמים G לשטוף את קרום עמוד ספין להשליך את הזרימה דרך. חזור על שלב זה באמצעות 350 מיקרוליטרים אחרים של מאגר RW1 לפני שתמשיך לשלב הבא. הוסף 500 מיקרוליטרים של RPE של מאגר לעמודת הסיבוב.
צנטריפוגה במשך 15 שניות יותר מ 8, 000 פעמים G לשטוף את קרום עמוד ספין. השלך את הזרימה והמשך לחזור על שלב זה על-ידי הוספת 500 מיקרוליטרים נוספים של RPE של מאגר לעמודת הסיבוב. הפעם, צנטריפוגה במשך שתי דקות יותר מ 8.000 פעמים G לשטוף את קרום עמוד ספין.
השלך את הזרימה דרך והצב את עמודת הספין בצינור איסוף חדש של שני מיליליטר והמשך לצנטריפוגה במהירות מלאה למשך דקה אחת כדי להסיר כל מאגר שיורית שעשוי להיות נוכח בעמודת הספין. השלך את הזרימה דרך והצב את עמוד הסיבוב בצינור איסוף חדש של 1.5 מיליליטר. המשך להוסיף 30 עד 50 microliters של מים חינם RNase ישירות קרום עמוד ספין.
צנטריפוגה במשך דקה אחת יותר מ 8, 000 פעמים G כדי לחמק RNA מן קרום עמוד ספין. בשלב זה, ה-RNA שלך מומס במים חופשיים RNase וייתכן שיהיה מאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שנה. המשך לכמת ולבדוק את טוהר הרנ"א שבודדת באמצעות ספקטרופוטומטר.
אתם מחפשים שיא ב 260 ננומטר, שהוא חומצת גרעין, כולל RNA, סופג באופן מקסימלי. הכמות מתוארת בחלק הימני התחתון של התמונה בננוגרם למיקרוליטר. ניתן להסיק איכות על ידי יחס 260 230 המוצג פריט אחד מעל הכמות בחלק הימני התחתון של המסך.
הגישה שלנו הראתה תשואות RNA נמוכות, במיוחד כאשר טיהרנו mRNA מרקמות הלב או מרקמות שהוקפאו בעבר. לכן אנחנו צריכים לבחור את התנאים כדי להגדיל את התשואות. עם זאת, התבוננו בעכברים לקויים ספציפיים ל-CD-36 EC, רמת האפרין B2 ו- DLL4 הוגדלה באופן משמעותי הן באנדוטליה של הריאות והן בלב, בהשוואה לבקרה.
תוצאות אלה היו עולות בקנה אחד עם מחקרי במבחנה הקודמים שלנו, אשר עולה כי איכות RNA מספיק לניתוח במורד הזרם. התשואה הייתה נמוכה בשל התנאים המחמירים בסביבת העבודה שלנו. כדי להתגבר על מגבלה זו, זה קריטי להקים אזור עבודה חינם RNase לטהר משטחי עבודה וציוד שעלולים לקבל מזוהמים עם RNase ולהחליף כפפות לעתים קרובות על מנת לחלץ RNA איכות ולהגדיל את התשואות.
זה גם קריטי למצוא ריכוזים מתאימים של נוגדני GFP במטריצת הזיקה ולהשתמש בריכוזים מתאימים של מעכבי RNase במאגר תריס הרקמה ולהשתמש RNase כלי פלסטיק חינם ריאגנטים עבור מיצוי RNA מן ריבוזום אנדותל של הרקמות הממוקדות.
