Hallo, ich bin Bin Ren, ich bin ein außerordentlicher Professor für Chirurgie und biomedizinische Technik an der University of Alabama der Birmingham School of Medicine. Unser Labor interessiert sich für Endothelzellbiologie Funktion Angiogenese Akuogenese im Zusammenhang mit diesen häufigen Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebserkrankungen. Einer unserer Forschungsschwerpunkte ist die epigenetische und Transkriptionsregulation der Endothelzelltransdifferenzierung und Angiogenese.
Um die Transkriptionsmechanismen der Angiogenese zu verstehen, haben wir transgene, konstruierte Mauslinien etabliert, in denen wir nicht nur ein bestimmtes Gen gelöscht haben, das mit der Angiogenese in den Endothelzellen assoziiert ist, sondern eine verbesserte GFP-Sonde genetisch auf ein Ribosom einheimischer Endothelzellen markiert wird. Auf diese Weise können wir Schleifen der zugehörigen Boten-RNA aus Endothelzellen in verschiedenen Gewebeorganen direkt bei transgenen Tieren isolieren und reinigen. Wir können dann die gereinigte Boten-RNA für die nachgelagerte Analyse von Transkripten und dem Transkriptom verwenden.
Durch RNA-Sequenzierung und die Echtzeit-Chill PCR. In diesem Video zeigen Ihnen meine Studenten Patrick Moran und Jordan Palmer sowie die Forschungstechniker Nicholas Barnekow und Rong Yuan einen Ansatz, der transgene Mäuse und die ansaugende Boten-RNA direkt aus dem Endothel bei den transgenen Tieren genotypisiert. Genotypisierung ist eine wichtige Vorstufe in diesem Protokoll, um sicherzustellen, dass das Eis das GFP-Tag auf den Ribosomen von Endothelzellen hat.
Da alle nachgeschalteten RNAi-Isolationsschritte auf dem Vorhandensein von GFP-markierten Ribosomen beruhen, ist es wichtig, den Genotyp vor Beginn des Experiments zu bestimmen. Vor Beginn der RNA-Isolierung müssen mehrere vorbereitende Schritte abgeschlossen werden. Dazu gehören die Puffervorbereitung und die Bindung des Anti-GFP-Antikörpers an das Protein G dina Perlen.
Die Puffer können bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius und die antikörpergebundenen Perlen bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius halten. Berücksichtigen Sie also diese Einschränkungen bei der Planung Ihres Experiments. Die Verwendung eines molaren getriebenen Homogenisators ist eine hervorragende Möglichkeit, die RNA-Ausbeute zu erhöhen.
Achten Sie darauf, niedrigere Frequenzeinstellungen und -dauern zu verwenden, um den RNA-Abbau zu reduzieren. Wie bereits erwähnt, ist die Genotypisierung ein wichtiger Vorschritt im Versuchsprotokoll. Die Sicherstellung, dass Mäuse, deren RNA mit der TRAP-Technik isoliert werden soll, positiv für das TRAP-Gen sind, zumindest Heterozygoten, aber idealerweise homozygot für das TRAP-Gen ist ein wichtiger Schritt, denn sicherzustellen, dass das GFP-Tag auf dem Ribosom ist, ist wichtig, um mit der Antigen-Antikörper-Reaktion und den Anti-GFP-Perlen, die Sie vor Beginn des Experiments vorbereitet haben, nach unten zu ziehen.
Isolieren Sie das gewünschte Gewebe von der Maus und legen Sie es sofort in eine eiskalte PBS mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Cyclohexamid-Lösung. Dadurch wird sichergestellt, dass die Übersetzung gestoppt wird und dass das Transkriptom eine genaue Darstellung der Maus vor der Euthanasie ist. Verwenden Sie einen motorgetriebenen Homogenisator, um das Gewebe in eine Zellsuspension zu homogenisieren.
Ideale Timing- und Frequenzeinstellungen müssen vom einzelnen Labor anhand des jeweiligen motorgetriebenen Homogenisators bestimmt werden, den Sie verwenden werden. Die Verwendung einer zu hohen Frequenzeinstellung kann zu einem RNA-Abbau führen und den Rest des Protokolls stören. Setzen Sie das Zellpellet innerhalb des Lysepuffers aus, den Sie vor Beginn des Experiments vorbereitet haben sollten.
Achten Sie darauf, diese Mischung weiter zu homogenisieren, um eine angemessene Homogenisierung zu gewährleisten, bevor Sie mit dem Rest des Protokolls fortfahren. Zentrifugieren Sie das Homogenat für 10 Minuten bei 2 000 mal G in einer Vier-Grad-Celsius-Zentrifuge. Dadurch werden die Kerne und die großen zellulären Trümmer, die die nachgeschaltete Immunpräzipitationsreaktion stören können, pellet.
Fügen Sie dem Überstand aus dem vorherigen Zentrifugalisierungsschritt DHPC- und CA-630-Lipide hinzu. Diese Lipide werden helfen, die Proteinphasen von den anderen intrazellulären Komponenten zu trennen. Legen Sie die Suspension für fünf Minuten auf Eis und lassen Sie sie sitzen.
Zentrifugieren Sie das Lysat 10 Minuten lang bei 13.000 mal G, um lösliches Material zu pelleten. Halten Sie 15% des klaren Lysats für zukünftige Schritte. Fügen Sie die Anti-GFP-Antikörper gebundenen Perlen zum Zelllysat-Überstand hinzu und inkubieren Sie die Mischung bei vier Grad Celsius mit End-over-End-Rotation für 30 Minuten.
Hier binden die Anti-GFP-Antikörper die GFP-markierten Ribosomen, so dass wir die RNA weiter von diesen Ribosomen isolieren können. Sammeln Sie die Perlen auf Ihrem magnetischen Rack und waschen Sie die Perlen fünfmal mit Ihrem hochsalzigen Polysomen-Waschpuffer, den Sie vor Beginn der Isolierung vorbereitet haben. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, in dem Sie die Perlen im RLT-Puffer platzieren.
Zentrifugieren Sie das Lysat drei Minuten lang mit voller Geschwindigkeit und entfernen Sie den Überstand vorsichtig und übertragen Sie ihn in ein neues Mikrofugenrohr. Fügen Sie dem geclearten Lysat ein Volumen von 70% Ethanol hinzu und mischen Sie es sofort durch Pipettieren. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, in dem Sie bis zu 700 Mikroliter der Probe, einschließlich aller möglicherweise gebildeten Fällungen, in eine Spin-Säule übertragen, die in einem Zwei-Milliliter-Sammelrohr platziert ist.
Zentrifugieren Sie das Lysat 15 Sekunden lang bei mehr als 8 000 mal G, um die Spinsäulenmembran zu waschen. Verwerfen Sie den Durchfluss, und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Fügen Sie der Spinspalte 350 Mikroliter Puffer RW1 hinzu.
Zentrifuge für 15 Sekunden bei mehr als 8.000 mal G, um die Spinsäulenmembran zu waschen und den Durchfluss durchzuwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt mit weiteren 350 MikroliterPuffer RW1, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Fügen Sie der Spinspalte 500 Mikroliter Puffer-RPE hinzu.
Zentrifuge für 15 Sekunden bei mehr als 8.000 mal G, um die Spinsäulenmembran zu waschen. Verwerfen Sie den Durchfluss, und wiederholen Sie diesen Schritt, indem Sie der Spinspalte weitere 500 Mikroliter Puffer-RPE hinzufügen. Diesmal zentrifugieren Sie zwei Minuten bei mehr als 8.000 mal G, um die Spinsäulenmembran zu waschen.
Entsorgen Sie den Durchfluss und legen Sie die Spin-Säule in ein neues Zwei-Milliliter-Sammelrohr, und fahren Sie mit voller Geschwindigkeit eine Minute lang zur Zentrifuge, um den Restpuffer zu entfernen, der möglicherweise auf der Spinspalte vorhanden ist. Entsorgen Sie den Durchfluss und platzieren Sie die Spin-Säule in einem neuen 1,5-Milliliter-Sammelrohr. Fahren Sie fort, 30 bis 50 Mikroliter RNase freies Wasser direkt in die Spinsäulenmembran zu geben.
Zentrifugieren Sie für eine Minute bei mehr als 8 000 mal G, um die RNA aus der Spin-Säulenmembran zu löschen. An diesem Punkt wird Ihre RNA in RNase-freiem Wasser aufgelöst und kann bis zu einem Jahr bei minus 80 Grad Celsius gespeichert werden. Fahren Sie fort, die Reinheit der RNA, die Sie isoliert haben, mit einem Spektralphotometer zu quantifizieren und zu überprüfen.
Sie suchen einen Peak bei 260 Nanometern, der Nukleinsäure, einschließlich RNA, maximal absorbiert. Die Menge wird im unteren rechten Teil des Bildes in Nanogramm pro Mikroliter dargestellt. Die Qualität lässt sich durch das Verhältnis 260 230 ableiten, das einen Artikel über der Menge im unteren rechten Teil des Bildschirms zeigt.
Unser Ansatz zeigte niedrige RNA-Ausbeute, besonders wenn wir mRNA aus dem Herzgewebe oder aus zuvor gefrorenen Geweben gereinigt haben. Wir müssen also die Bedingungen nutzen, um die Erträge zu steigern. Bei EG-spezifischen CD-36-Mäusen beobachteten wir jedoch, dass der Ephrin-B2- und DLL4-Spiegel sowohl bei der Lungen- als auch bei der Herzendothelie im Vergleich zur Kontrolle signifikant erhöht war.
Diese Ergebnisse stimmten mit unseren früheren In-vitro-Studien überein, was darauf hindeutet, dass die RNA-Qualität für nachgelagerte Analysen ausreicht. Die Ausbeute war aufgrund der strengen Bedingungen in unserem Arbeitsbereich gering. Um diese Einschränkung zu überwinden, ist es wichtig, eine RNase freie Arbeitszone einzurichten und Arbeitsflächen und Geräte zu dekontaminieren, die mit RNase kontaminiert werden können, und Handschuhe häufig zu wechseln, um hochwertige RNA zu extrahieren und die Erträge zu erhöhen.
Es ist auch wichtig, geeignete Konzentrationen von GFP-Antikörpern in der Affinitätsmatrix zu finden und geeignete Konzentrationen von RNase-Inhibitoren im Gewebelysepuffer zu verwenden und RNase-freie Kunststoffware und Reagenzien für die RNA-Extraktion aus endotheliaalen Ribosomen des Zielgewebes zu verwenden.
