翻译核糖体亲性纯化(TRAP),用于从体内内皮细胞中分离RNA

嗨，我是任斌，我是阿拉巴马大学伯明翰医学院外科和生物医学工程学副教授。我们的实验室对内皮细胞生物学在这些常见的心血管疾病和癌症背景下的血管生成功能感兴趣。我们的研究重点是内皮细胞转位和血管生成表观遗传和转录调控。

为了理解血管生成学的转录机制，我们建立了转基因工程小鼠线，其中我们不仅删除了内皮细胞中与血管生成相关的特定基因，而且增强的GP探针将被基因标记在原生内皮细胞的核糖体上。这样，我们可以直接从转基因动物的不同组织器官内皮细胞中分离和纯化相关信使RNA的循环。然后，我们可以使用纯化信使RNA对转录本和转录组进行下游分析。

通过RNA测序和实时冷PCR。在这段视频中，我的学生帕特里克·莫兰和乔丹·帕尔默以及研究技术人员尼古拉斯·巴内考和荣元将向您展示一种从转基因动物内皮直接进行基因分型和吸气信使RNA的方法。基因分型是本协议中一个重要的初步结果，以确保冰在内皮细胞的核糖体上具有GP标签。

由于所有下游RNAi分离步骤都依赖于GP标记核糖体的存在，因此在开始实验之前确定基因型至关重要。在开始RNA分离之前，必须完成几个准备步骤。这些包括缓冲制剂和结合抗GP抗体的蛋白质G迪纳珠。

缓冲液在4摄氏度下可以持续一个月，抗体结合的珠子在4摄氏度下可以持续一周。因此，在计划实验时，要考虑到这些限制。使用摩尔驱动的均质剂是提高RNA产量的极好方法。

请务必使用较低的频率设置和持续时间，以减少RNA降解。如前所述，基因分型是试验协议中重要的初步步骤。确保使用 TRAP 技术分离 RNA 的小鼠对 TRAP 基因（至少是异质酶）呈阳性，但 TRAP 基因的理想同源是一个重要的步骤，因为确保 GFP 标签位于核糖体上对于使用抗原抗体反应和在开始实验前准备的抗 GFP 珠子进行向下拉是必不可少的。

将所需的组织从小鼠中分离，并立即放入冰冷 PBS 中，每毫升环氧酰胺溶液为 100 微克。这可确保停止翻译，并且转录组在安乐死之前对鼠标进行准确的描述。使用电机驱动的均质器将组织均匀化到细胞悬浮液中。

理想的定时和频率设置将由各个实验室根据您将使用的特定电机驱动均质器确定。使用过高的频率设置会导致RNA降解，并破坏协议的其余部分。将细胞颗粒悬浮在实验前应准备好的解液缓冲液中。

在继续执行协议的其余部分之前，确保进一步使这种混合物均质，以确保足够的均质化。在4摄氏度的离心机中，以2000倍G离心10分钟。这将颗粒核和大细胞碎片，可能会干扰下游免疫沉淀反应。

从先前的离心步骤将DHPC和CA-630脂质添加到上心。这些脂质将有助于将蛋白质相位与其他细胞内成分分离出来。将悬架放在冰上五分钟，让其坐下。

将溶糖在13，000倍G下离心10分钟，以对任何可溶性材料进行颗粒化。为将来的步骤保留 15% 的透明 lysate。将抗G进给的抗体结合珠子加入细胞中，解血中上流剂，在4摄氏度下孵育混合物，结束结束旋转30分钟。

这是抗G进位抗体结合GP标记的核糖体，使我们能够进一步分离RNA从这些核糖体。收集磁架上的珠子，使用高盐多体洗涤缓冲液洗珠五次，在开始隔离之前，您将准备好这些缓冲液。立即继续执行下一步，您将将珠子放在 RLT 缓冲区中。

全速离离液三分钟，小心地取出上一代，并将其转移到新的微模糊管中。将一卷70%乙醇加入清除的利盐中，并立即通过移液混合。立即进入下一步，您将将样品的700微升（包括可能形成的任何沉淀物）转移到放置在两毫升收集管中的旋转柱中。

在大于8，000倍G下将裂酸离心15秒，以清洗旋转柱膜。放弃流，然后继续执行下一步。向旋转列添加 350 微升缓冲 RW1。

在大于 8，000 倍 G 时离心 15 秒，清洗旋转柱膜并丢弃流经。在继续下一步之前，使用另外 350 微升的缓冲器 RW1 重复此步骤。向旋转列添加 500 微升缓冲 RPE。

在大于8000倍G时离心15秒，清洗旋转柱膜。放弃流，然后继续重复此步骤，向旋转列添加另外 500 微升的缓冲区 RPE。这一次，离心机两分钟在大于8.000G时清洗旋转柱膜。

丢弃流，将旋转柱放在新的两毫升收集管中，然后以全速进入离心机一分钟，以清除旋转柱上可能存在的任何残余缓冲液。丢弃流，将旋转柱放在新的 1.5 毫升收集管中。继续将30至50微升的RNase无水直接添加到旋转柱膜中。

在大于8，000倍G下离心1分钟，从旋转柱膜中分离出RNA。此时，您的RNA溶解在无RNase水中，并可能在零下80摄氏度下储存长达一年。继续使用分光光度计量化和检查您分离的RNA的纯度。

你正在寻找一个峰值在260纳米，这是核酸，包括RNA，吸收最大。数量以微升的南图在图像的右下半部分显示。质量可以推断为 260 230 比率，该比率显示的是屏幕右下部数量上方的一项。

我们的方法显示RNA产量低，特别是当我们从心脏组织或以前冷冻的组织纯化mRNA时。因此，我们需要对提高产量的条件进行雾化。然而，我们确实在EC特定的CD-36缺陷小鼠中观察到，与对照组相比，Ephrin B2和DLL4水平在肺和心脏内膜都显著增加。

这些结果与我们之前的体外研究一致，这表明RNA质量足以进行下游分析。由于我们工作空间的严格条件，产量很低。为了克服这一限制，必须建立一个无 RNase 工作区，并净化可能受到 RNase 污染的工作表面和设备，并经常更换手套，以提取高质量的 RNA 并提高产量。

在亲和力基质中找到合适的GGFP抗体浓度，并在组织解解缓冲液中使用适当浓度的RNase抑制剂，并使用无RNase塑料软件和试剂从目标组织的内皮核糖体中提取RNA也至关重要。