Ciao, sono Bin Ren, sono professore associato di chirurgia e ingegneria biomedica all'Università dell'Alabama alla Birmingham School of Medicine. Il nostro laboratorio è interessato alla funzione di angiogenesi della funzione di biologia cellulare endoteliale nel contesto di queste comuni malattie cardiovascolari e tumori. Una delle nostre ricerche si concentra sulla regolazione epigenetica e trascrizione della transdifferenziazione endoteliale delle cellule e dell'angiogenesi.
Per comprendere i meccanismi trascrittivi dell'angiogenesi, abbiamo stabilito linee di topo ingegnerizzate transgeniche, in cui non solo abbiamo eliminato uno specifico geni associato all'angiogenesi nelle cellule endoteliali, ma una sonda GFP potenziata sarà geneticamente taggata su un ribosoma di cellule endoteliali native. In questo modo, possiamo isolare e purificare anelli di RNA messaggero associato da cellule endoteliali in diversi organi tissutali direttamente negli animali transgenici. Possiamo quindi usare l'RNA messaggero purificato per l'analisi a valle delle trascrizioni e del trascrittame.
Con il sequenziamento dell'RNA e la PCR fredda in tempo reale. In questo video, i miei studenti Patrick Moran e Jordan Palmer e i tecnici di ricerca Nicholas Barnekow e Rong Yuan vi mostreranno un approccio che genotipizza i topi transgenici e l'aspirazione dell'RNA messaggero direttamente dall'endoteliale negli animali transgenici. La genotipizzazione è un importante preliminare in questo protocollo per garantire che il ghiaccio abbia il tag GFP sui ribosomi delle cellule endoteliali.
Poiché tutti i passaggi di isolamento RNAi a valle si basano sulla presenza di ribosomi taggati GFP, è essenziale determinare il genotipo prima di iniziare l'esperimento. Prima di iniziare l'isolamento dell'RNA, è necessario completare diverse fasi preparatorie. Questi includono la preparazione tampone e il legame dell'anticorpo anti-GFP alle perline di dina G proteiche.
I tamponi possono durare fino a un mese a quattro gradi Celsius e le perline legate agli anticorpi possono durare fino a una settimana a quattro gradi Celsius. Quindi prendi in considerazione queste limitazioni quando pianifichiamo il tuo esperimento. L'uso di un omogeneizzatore a spinta molare è un modo eccellente per aumentare la resa dell'RNA.
Assicurati di utilizzare impostazioni e durate di frequenza inferiore per ridurre la degradazione dell'RNA. Come accennato in precedenza, il genotipizzazione è un importante passo preliminare nel protocollo di prova. Garantire che i topi il cui RNA deve essere isolato utilizzando la tecnica TRAP siano positivi per il gene TRAP, almeno gli eterozigoti, ma idealmente omozigoti per il gene TRAP è un passo importante perché garantire che il tag GFP sia sul ribosoma è essenziale per ritirarsi usando la reazione anticorpale dell'antigene e le perline anti-GFP che avrai preparato prima di iniziare l'esperimento.
Isolare i tessuti desiderati dal mouse e posizionarli immediatamente in un PBS ghiacciato con soluzione di cicloesamide da 100 microgrammi per millilitro. Ciò garantisce che la traduzione venga interrotta e che il trascrittame sia una rappresentazione accurata del mouse prima dell'eutanasia. Utilizzare un omogeneizzatore motorizzatore per omogeneizzare il tessuto in una sospensione cellulare.
Le impostazioni ideali di temporizzazione e frequenza dovranno essere determinate dal singolo laboratorio in base al particolare omogeneizzatore a motore che utilizzerai. L'uso di un'impostazione di frequenza troppo alta può portare alla degradazione dell'RNA e interrompere il resto del protocollo. Sospendere il pellet di cella all'interno del tampone dilisi che si dovrebbe preparare prima di iniziare l'esperimento.
Assicurarsi di omogeneizzare ulteriormente questa miscela al fine di garantire un'adeguata omogeneizzazione prima di procedere con il resto del protocollo. Centrifugare l'omogeneato per 10 minuti a 2.000 volte G in una centrifuga di quattro gradi Celsius. Ciò si pelletterà i nuclei e i grandi detriti cellulari che possono interferire con la reazione di immunoprecipitazione a valle.
Aggiungere lipidi DHPC e CA-630 al supernatante dalla fase di centrifugazione precedente. Questi lipidi aiuteranno a separare le fasi proteiche dagli altri componenti intracellulari. Posizionare la sospensione sul ghiaccio per cinque minuti e lasciare riposare.
Centrifugare il lysate per 10 minuti a 13.000 volte G per pelletare qualsiasi materiale solubile. Mantenere il 15% del lysate chiaro per i passaggi futuri. Aggiungere le perline legate all'anticorpo anti-GFP al supernatante lisato cellulare e incubare la miscela a quattro gradi Celsius con rotazione finale su fine per 30 minuti.
È qui che gli anticorpi anti-GFP legheranno i ribosomi taggati GFP, permettendoci di isolare ulteriormente l'RNA da questi ribosomi. Raccogli le perline sul rack magnetico e lava le perline cinque volte usando il tuo tampone di lavaggio polisome ad alto sale che avrai preparato prima di iniziare l'isolamento. Procedere immediatamente al passaggio successivo in cui si posizioneranno le perline nel buffer RLT.
Centrifugare il lysate per tre minuti a tutta velocità e rimuovere con cura il supernatante e trasferirlo su un nuovo tubo di microfugo. Aggiungere un volume di 70%etanolo al lysate sgombrato e mescolare immediatamente con pipettazione. Procedere immediatamente al passaggio successivo in cui si trasferiranno fino a 700 microlitri del campione, incluso qualsiasi precipitato che potrebbe aver formato, in una colonna di spin posta in un tubo di raccolta a due millilitri.
Centrifugare il lysate per 15 secondi a più di 8.000 volte G per lavare la membrana della colonna di rotazione. Scartare il flusso e procedere al passaggio successivo. Aggiungere 350 microlitri di buffer RW1 alla colonna di rotazione.
Centrifugare per 15 secondi a più di 8.000 volte G per lavare la membrana della colonna di spin e scartare il flusso. Ripetere questo passaggio utilizzando altri 350 microlitri di buffer RW1 prima di procedere al passaggio successivo. Aggiungere 500 microlitri di buffer RPE alla colonna di rotazione.
Centrifugare per 15 secondi a più di 8.000 volte G per lavare la membrana della colonna di rotazione. Scartare il flusso e procedere a ripetere questo passaggio aggiungendo altri 500 microlitri di buffer RPE alla colonna di rotazione. Questa volta, centrifugare per due minuti a più di 8.000 volte G per lavare la membrana della colonna di rotazione.
Scartare il flusso attraverso e posizionare la colonna di rotazione in un nuovo tubo di raccolta a due millilitri e procedere alla centrifugazione a tutta velocità per un minuto per rimuovere qualsiasi tampone residuo che potrebbe essere presente sulla colonna di rotazione. Scartare il flusso e posizionare la colonna di rotazione in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 millilitri. Procedere ad aggiungere da 30 a 50 microlitri di acqua libera da RNasi direttamente alla membrana della colonna di rotazione.
Centrifugare per un minuto a più di 8.000 volte G per elutare l'RNA dalla membrana della colonna di spin. A questo punto, l'RNA viene sciolto in acqua libera da RNasi e può essere conservato a meno 80 gradi Celsius per un massimo di un anno. Procedere a quantificare e controllare la purezza dell'RNA isolato utilizzando uno spettrofotometro.
Stai cercando un picco a 260 nanometri, che è acido nucleico, incluso l'RNA, assorbe al massimo. La quantità è raffigurata nella parte inferiore destra dell'immagine in nanogrammi per microlitro. La qualità può essere dedotta dal rapporto 260 230 che mostra un articolo sopra la quantità nella parte in basso a destra dello schermo.
Il nostro approccio ha mostrato basse rese di RNA, specialmente quando abbiamo purificato l'mRNA dai tessuti cardiaci o dai tessuti precedentemente congelati. Dobbiamo quindi optare per le condizioni per aumentare i rendimenti. Tuttavia, abbiamo osservato in EC specifici topi carenti di CD-36, il livello di efrina B2 e DLL4 è stato significativamente aumentato sia nell'endotelia polmonare che in quello cardiaca, rispetto al controllo.
Questi risultati sono stati coerenti con i nostri precedenti studi in vitro, il che suggerisce che la qualità dell'RNA è sufficiente per l'analisi a valle. La resa è stata bassa a causa delle rigorose condizioni nel nostro spazio di lavoro. Per superare questa limitazione, è fondamentale creare una zona di lavoro libera dalla RNasi e decontaminare superfici di lavoro e attrezzature che possono essere contaminate da RNasi e cambiare frequentemente i guanti al fine di estrarre RNA di qualità e aumentare le rese.
È inoltre fondamentale trovare concentrazioni adeguate di anticorpi GFP nella matrice di affinità e utilizzare concentrazioni appropriate di inibitore della RNasi nel tampone di lisi tissutale e utilizzare materiale plastico privo di RNasi e reagenti per l'estrazione dell'RNA da ribosomi endoteliali dei tessuti mirati.
