البروتينات RNA ملزمة ضرورية لعلم وظائف الأعضاء الخلوية. الأهم من ذلك، يتم التعبير عن RBP بشكل كبير في جميع أنحاء تكوين الحيوانات المنوية وتم توثيقها جيدًا كمنظمين أساسيين بعد النسخ أثناء جميع مراحل الخلايا الجرثومية. وتحديد الأهداف الملزمة أمر بالغ الأهمية لتوضيح الأدوار الآلية لـ RBP.
ويمثل هذا البروتوكول تطبيقاً مكيّفاً لطريقة eCLIP لالتقاط أهداف الحمض النووي الريبي المباشر الذاتية، وينشئ أساساً قابلاً للتطبيق لـ eCLIP في الخصية الثديية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في أنها غير مشعة، وأقل كثافة للوقت، وتوفر نسبة أقوى من الإشارة إلى الضوضاء لأن المدخلات المتطابقة بالحجم ستكون بمثابة خلفية مناسبة للأهداف الحقيقية. وأخيرا، نعتقد أن التسلسل الصغير النطاق للركول الفرعية مفيد في متابعة التسلسل العميق.
و سيكون شو تشيوشى زميلى هو الذى يظهر هذا الإجراء لبدء هذا الإجراء، حصاد حوالي 100 ملليغرام من الخصيصات من الفئران من العمر المناسب لكل تجربة المناعة. ضع الأنسجة في الثلج البارد PBS.
باستخدام زوج من ملاقط ذات رؤوس دقيقة، قم بإزالة تونيكا ألبوجينا بلطف. إضافة ثلاثة ملليلترات من الجليد البارد PBS إلى طاحونة الأنسجة، واستخدام آفة الزجاج فضفاضة لtriturate الأنسجة بالقوة الميكانيكية خفيفة. بعد ذلك، نقل تعليق الأنسجة إلى طبق ثقافة الخلية، وإضافة الجليد البارد برنامج تلفزيوني يصل إلى ستة ملليلتر.
يهز لوحة بسرعة بحيث يغطي السائل الجزء السفلي من الطبق بالتساوي. ربط التعليق على الجليد ثلاث مرات مع 400 ملليجول لكل سنتيمتر مربع في 254 نانومتر. تأكد من خلط التعليق بين كل تشعيع.
ثم، وجمع تعليق في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، والطرد المركزي في 1، 200 مرة ز وعلى أربع درجات لمدة خمس دقائق. إزالة ناظر، وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. بعد ذلك، نقل التعليق إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 1.5 ملليلتر.
جهاز طرد مركزي في 1،000 مرة ز و أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين، والتخلص من فائقة. أولا، إضافة 125 ميكرولترات من البروتين الخرز المغناطيسي لكل عينة إلى أنبوب طرد مركزي جديد. وضع أنبوب على المغناطيس لفصل الخرز من الحل.
بعد 10 ثوان ، قم بإزالة المابير ، وغسل الخرز مرتين بميليلتر واحد من عازلة التحلل الباردة للجليد. Resuspend الخرز في 100 ميكرولترات من عازلة التحلل الباردة مع 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة eCLIP. قم بتدوير الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
ثم، وغسل الخرز مرتين مع ملليلتر واحد من الجليد الباردة العازلة. للبدء، resuspend الكريات الأنسجة في ملليلتر واحد من عازلة تحلل الباردة التي تحتوي على 22 ميكرولترات من 50x EDTA خالية من البروتين المانع كوكتيل و 11 ميكرولترات من مثبط RNase. الحفاظ على عينات على الجليد لمدة 15 دقيقة.
Sonicate كل عينة كما هو موضح في بروتوكول النص. المقبل، إضافة أربعة microliters من DNase إلى كل أنبوب ومزيج جيد. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في حين تهتز في 1، 200 دورة في الدقيقة.
بعد ذلك، إضافة 10 ميكرولترات من RNase المخفف ومزيج جيد. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق بينما تهتز في 1، 200 دورة في الدقيقة. ثم، الطرد المركزي في 15،000 مرة ز وعند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لمسح lysate.
جمع بعناية فائقة، وحفظ عينات المدخلات لعينات RWB وRRI. أولاً، أضف ملليلتر واحد من اللسات إلى الخرز المعد، وتدوير العينات عند أربع درجات مئوية إما لمدة ساعتين أو بين عشية وضحاها. بعد هذا، وجمع الخرز مع موقف مغناطيسي، وتجاهل ناظر.
غسل الخرز مرتين مع 900 ميكرولترات من العازلة عالية الملح، ومن ثم غسل الخرز مرتين مع 900 ميكروليتر من العازلة الغسيل. ثم، وغسل الخرز مرة واحدة مع 500 ميكرولترات من 1x عازلة dephosphorylation. أولاً، تخلص من الماظر الفائقة، واستخدم نصائح ماصة دقيقة لإزالة أي سائل متبقي.
إضافة 25 ميكروليتر من ثلاثة رئيس المزيج الرئيسي الربط إلى كل عينة، وماصة بعناية لخلط. إضافة 2.5 ميكرولترات من محول RNA X1A و 2.5 ميكرولترات من محول RNA X1B لكل عينة. مزيج بعناية عن طريق الأنابيب أو الخفقان.
احتضان في 25 درجة مئوية لمدة 75 دقيقة، مع التأكد من نفض الغبار أنبوب لخلط كل 10 دقيقة. غسل الخرز مرة واحدة مع 500 ميكرولترات من عازلة غسل الباردة. بعد ذلك ، اغسل الخرز مرة واحدة مع 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت عالي الملح البارد ثم مع 500 ميكرولتر من عازلة الغسيل البارد.
كرر كل من هذه يغسل مرة أخرى. المغناطيسي فصل الخرز، واستخدام نصائح دقيقة ماصة لإزالة أي السائل المتبقية. Resuspend الخرز في 100 ميكرولترات من عازلة غسل الباردة، ونقل 20 ميكرولترات إلى أنابيب جديدة وعينات RWB.
إضافة 7.5 ميكرولترات من 4x LDS عينة العازلة وثلاثة ميكرولترات من 10x عينة وكيل الحد من العينات المتبقية. احتضان في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بينما تهتز في 1، 200 دورة في الدقيقة. بعد هذا، تبريد العينات على الجليد لمدة دقيقة واحدة، والطرد المركزي في 1،000 مرات ز وعند أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة.
لRWB هلام، ووضع أنابيب على المغناطيس، وتيّل البروتين منفصلة من الخرز. تحميل 15 ميكرولترات من عينة في كل بئر. بعد ذلك، إضافة 500 ميكرولترات من مضادات الأكسدة إلى 500 ملليلتر من 1x SDS تشغيل العازلة.
تشغيل الجل في 200 فولت، 1x SDS تشغيل العازلة لمدة 50 دقيقة أو حتى الجبهة صبغ في الجزء السفلي. نقل مجمعات البروتين RNA من هلام إلى غشاء نيتروسيلولوز في 10 فولت لمدة 70 دقيقة في 1x نقل العازلة مع 10٪ الميثانول. منع غشاء RWB في 5٪ الحليب في TBST في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
شطف الغشاء في TBST، واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية في TBST بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. بعد ذلك، اغسل مرتين مع TBST، مع كل غسل يدوم خمس دقائق. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية في TBST في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
ثم، وغسل الغشاء ثلاث مرات مع TBST. المقبل, مزيج وحدات التخزين متساوية من المخزن A ECL والعازل B.Add هذا الخليط إلى الغشاء, واحتضان لمدة دقيقة واحدة. غطي الغشاء بلفاف بلاستيكي، وتعرّضه لفيلم أشعة سينية في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق قبل تطوير الفيلم.
في هذه الدراسة ، MOV10 eCLIP في الخصيات من الفئران من النوع البري الكبار مع RNase أنا علاج lysate عبر الارتصال ، يتم إثراء البروتين المستهدف ، الذي هو ما يقرب من 114 كيلودالتون ، بنجاح. نتائج qPCR من cDNA المخفف واحد إلى 10 من عينات مختلفة يكشف أن العينات غير crosslinked تظهر انخفاض استرداد الحمض النووي الريبي. ويلاحظ أن قيم Ct للمجموعة غير ذات الروابط المتقاطعة تزيد عموماً خمس مرات عن مجموعة الأشعة فوق البنفسجية المتداخلة.
تظهر النتائج التمثيلية لتضخيم PCR واختيار الحجم عبر agarose هلام الكهرباء هنا. يظهر المنتج التمهيدي-الديمر في حوالي 140 زوجًا أساسيًا. عرض مستعرض الجينوم UCSC من اثنين من تسلسل subclone تمثيلية تبين أن علامات eCLIP منضم MOV10 وجدت أن تكون موجودة داخل UTR ثلاثة رئيس من الجينات Fto.
معدل تقريبي من ثلاثة prime UTR الأهداف تمثل 75٪ يتسق مع غالبية الأهداف MOV10 في خلايا HEK293 وفي الخصيات. وعلى النقيض من ذلك، تم العثور على علامات eCLIP منضمة MOV10L1 لتكون موجودة داخل كتلةrna، مما يشير إلى MOV10L1 يستهدف السلائف الرنا. ويمثل المعدل التقريبي لأهداف السلائف الخاصة ببيرنا 42 في المائة مما يعكس اتجاهاً من الدراسات السابقة.
MOV10L1 eCLIP مع 40 وحدة لكل ملليلتر RNase أنا هضم يعطي تسلسل أكثر نسبيا مع أزواج قاعدة أقل من 20. ويمثل هذا البروتوكول الموصوف هنا استخدام لأسلوب eCLIP في الاستنساخ، وهو مجال تكون فيه المعرفة بالتفاعل بين RNA و RBP غير كافية إلى حد ما.
