RNA bağlayıcı proteinler hücresel fizyoloji için gereklidir. Daha da önemlisi, RBP yüksek spermatogenez boyunca ifade edilir ve iyi mikrop hücrelerinin tüm aşamalarında gerekli post-transkripsiyonel düzenleyiciler olarak belgelenmiştir. Bağlayıcı hedeflerin belirlenmesi RBP'nin mekanik rollerini açıklamak için çok önemlidir.
Bu protokol, endojen direkt RNA hedeflerini yakalamak için eCLIP yönteminin uyarlanmış bir uygulamasını temsil eder ve memeli testlerinde eCLIP için geçerli bir temel oluşturur. Bu yöntemin en büyük avantajı, radyoaktif olmayan, daha az zaman yoğun olması ve boyut uyumlu giriş otantik hedefler için uygun bir arka plan olarak hizmet edeceği için daha güçlü bir sinyal-gürültü oranı sağlamasıdır. Son olarak, alt klonların küçük ölçekli sıralama derin sıralama aşağıdaki yararlı olduğunu düşünüyorum.
Prosedürü gösteren Xu Qiushi, meslektaşım olacak. Bu prosedüre başlamak için, her immünoprepitasyon deneyi için uygun yaştaki farelerden yaklaşık 100 miligram testis hasat edin. Dokuları buz gibi PBS'ye yerleştirin.
İnce uçlu cımbız bir çift kullanarak, yavaşça tunaica albuginea kaldırın. Bir doku öğütücüse üç mililitre buz gibi PBS ekleyin ve hafif mekanik kuvvetle doku triturate gevşek bir cam havaneli kullanın. Daha sonra, bir hücre kültür çanak doku süspansiyon aktarın ve altı mililitre kadar buz gibi PBS ekleyin.
Sıvı eşit yemeğin alt kapakları böylece hızlı bir şekilde plaka sallayın. 254 nanometre kare santimetre kare 400 milijoule ile buz üzerinde süspansiyon üç kez Crosslink. Süspansiyonu her ışınlama arasında karıştırdığından emin olun.
Daha sonra, 15 mililitrelik konik bir tüp içinde süspansiyon toplamak ve santrifüj 1, 200 kez g ve beş dakika boyunca dört derece. Supernatant çıkarın ve PBS bir mililitre pelet resuspend. Bundan sonra, 1.5 mililitrelik santrifüj tüp süspansiyon aktarın.
Santrifüj 1, 000 kez g ve iki dakika boyunca dört derece santigrat, ve supernatant atın. İlk olarak, taze bir santrifüj tüpüne numune başına 125 mikrolitre protein ekleyin. Çözelti boncukayırmak için mıknatıs üzerine tüp yerleştirin.
10 saniye sonra, supernatant çıkarın ve buz gibi lysis tampon bir mililitre ile iki kez boncuk yıkayın. 10 mikrogram eCLIP antikor ile 100 mikrolitre soğuk lysis tamponu boncukları yeniden askıya alın. Tüpleri oda sıcaklığında 45 dakika döndürün.
Daha sonra boncukları bir mililitre buz gibi lysis tamponuyla iki kez yıkayın. Başlamak için, 50x EDTA içermeyen protein inhibitörü kokteyl22 mikrolitre ve RNase inhibitörü 11 mikrolitre içeren soğuk lysis tampon bir mililitre doku pelet resuspend. Örnekleri 15 dakika buzüzerinde inceleyin.
Metin protokolünde belirtildiği gibi her örneği sonicate. Sonra, her tüp e dört mikrolitre DNase ekleyin ve iyice karıştırın. 1, 200 rpm sallayarak 10 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka.
Bundan sonra, seyreltilmiş RNase 10 mikrolitre ekleyin ve iyice karıştırın. 1, 200 rpm sallayarak beş dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Sonra, 15, 000 kez g ve lysate temizlemek için 20 dakika boyunca dört derece santigrat santrifüj.
Supernatant'ı dikkatlice toplayın ve giriş örneklerini RWB ve RRI örnekleri için kaydedin. İlk olarak, hazırlanan boncuklara bir mililitre lysat ekleyin ve numuneleri iki saat veya gece boyunca dört derece olarak döndürün. Bundan sonra, manyetik bir stand ile boncuk toplamak ve supernatant atın.
900 mikrolitre yüksek tuz tamponu yla boncukları iki kez yıkayın ve 900 mikrolitre yıkama tamponuyla boncukları iki kez yıkayın. Daha sonra boncukları 500 mikrolitre 1x defosforilasyon tamponu ile bir kez yıkayın. İlk olarak, supernatant atın ve herhangi bir kalıntı sıvı kaldırmak için ince pipet ipuçları kullanın.
Her numuneye 25 mikrolitre üç asal ligasyon ana karışımı ekleyin ve karıştırmak için dikkatlice pipet. Her numuneye 2,5 mikrolitre RNA adaptörü X1A ve 2,5 mikrolitre RNA adaptörü X1B ekleyin. Pipetleme veya hareket ettirerek dikkatlice karıştırın.
75 dakika boyunca 25 santigrat derecede kuluçkaya yatarak tüpün her 10 dakikada bir karıştırıldığından emin olun. Boncukları 500 mikrolitre soğuk yıkama tamponuyla bir kez yıkayın. Daha sonra, boncukları 500 mikrolitre soğuk yüksek tuz tamponu ve ardından 500 mikrolitre soğuk yıkama tamponu ile yıkayın.
Bu yıkıntıların her ikisini de bir kez daha tekrarlayın. Boncukları manyetik olarak ayırın ve artık sıvıyı çıkarmak için ince pipet uçları kullanın. Soğuk yıkama tampon 100 mikrolitre boncuk resuspend ve RWB örnekleri olarak yeni tüpler için 20 mikrolitre taşıyın.
Kalan numunelere 7,5 mikrolitre 4x LDS numune tamponu ve üç mikrolitre 10x numune azaltma maddesi ekleyin. 1, 200 rpm sallayarak 10 dakika boyunca 70 santigrat derecede kuluçka. Bundan sonra, bir dakika buz üzerinde örnekleri serin ve 1.000 kez g ve bir dakika için dört derece santigrat de santrifüj.
RWB jel için, bir mıknatıs üzerine tüpler yerleştirin ve ayrı protein boncuklar eluate. Her kuyuya 15 mikrolitre numune yükleyin. Daha sonra, 500 mililitre 1x SDS çalışan tampon antioksidan 500 mikrolitre ekleyin.
Jel i çalıştırın 200 volt, 1x SDS 50 dakika veya boya ön alt kadar tampon çalışan. Protein-RNA komplekslerini jelden nitroselüloz membrana 10 volt'ta 70 dakika boyunca 1x transfer tamponuna %10 metanol ile aktarın. Bir saat oda sıcaklığında TBST% 5 süt RWB membran blok.
TBST membran durular ve dört santigrat derece tbst bir gecede birincil antikor ile inkübat. Bundan sonra, TBST ile iki kez yıkayın, her yıkama beş dakika süren. Bir saat oda sıcaklığında TBST ikincil antikor ile kuluçka.
Daha sonra, TBST ile membran ı üç kez yıkayın. Daha sonra, eşit hacimlerde ECL tampon A ve tampon B.Bu karışımı membrana ekleyin ve bir dakika kuluçkaya yatırın. Membranı plastik sargı ile kapatın ve filmi geliştirmeden önce oda sıcaklığında 2-3 dakika x-ray filmine maruz bırakın.
Bu çalışmada, RNase I ile erişkin yabani tip farelerin testislerinde MOV10 eCLIP çapraz bağlı lysate tedavi, hedef protein, yaklaşık 114 kilodaltons, başarıyla zenginleştirilmiştir. Çeşitli örneklerden 1-10 arasında seyreltilmiş cDNA'nın qPCR sonuçları çapraz bağlanmamış örneklerde azalmış RNA geri kazanımı olduğunu ortaya koymaktadır. Çapraz bağlı olmayan grubun Ct değerlerinin genellikle UV-crosslinked grubundan beş kat daha fazla olduğu gözlenmiştir.
Agarose jel elektroforez ile PCR amplifikasyon ve boyut seçimi için temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. Astar-dimer ürün yaklaşık 140 baz çifti görünür. UCSC Genom Tarayıcısı'nın iki temsili subklon dizisi görünümü, MOV10'a bağlı eCLIP etiketlerinin Fto geninin üç asal UTR'si içinde bulunduğunu göstermektedir.
Üç asal UTR hedeflerinin yaklaşık oranı %75'tir hek293 hücrelerindeki ve testislerde bulunan MOV10 hedeflerinin çoğuyla tutarlıdır. Buna karşılık, MOV10L1 bağlı eCLIP etiketleri bir piRNA kümesi içinde bulunan bulunur, MOV10L1 hedefleri piRNA öncüleri gösteren. PiRNA öncül hedeflerinin yaklaşık oranı önceki çalışmalardan gelen bir eğilimi yansıtan %42'yi oluşturmaktadır.
MOV10L1 mililitre başına 40 birimlik RNase I sindirim ile eCLIP az 20 baz çiftleri ile nispeten daha fazla dizileri verir. Burada açıklanan bu protokol, RNA-RBP etkileşim bilgisinin yetersiz olduğu bir alan olan çoğaltmada eCLIP yönteminin istihdamını temsil eder.
