Le proteine leganti l'RNA sono essenziali per la fisiologia cellulare. È importante sottolineare che gli RBP sono altamente espressi in tutta la spermatogenesi e sono stati ben documentati come regolatori post-trascrittivi essenziali durante tutte le fasi delle cellule germinali. L'identificazione di obiettivi vincolanti è fondamentale per chiarire i ruoli meccanicistici di RBP.
Questo protocollo rappresenta un'applicazione adattata del metodo eCLIP per catturare obiettivi endogeni di RNA diretto e stabilisce una base applicabile per eCLIP nei testicoli dei mammiferi. Il vantaggio principale di questo metodo è che non è radioattivo, richiede meno tempo e fornisce un rapporto segnale-rumore più forte perché l'ingresso abbinato alle dimensioni fungerà da sfondo appropriato per obiettivi autentici. Infine, riteniamo che il sequenziamento su piccola scala dei subclones sia utile per seguire il sequenziamento profondo.
A dimostrare la procedura sarà Xu Qiushi, il mio collega. Per iniziare questa procedura, raccogliere circa 100 milligrammi di tester da topi di età appropriata per ogni esperimento di immunoprecipitazione. Posizionare i tessuti in PBS ghiacciato.
Utilizzando un paio di pinzette a punta fine, rimuovere delicatamente la tunica albuginea. Aggiungere tre millilitri di PBS ghiacciato a una smerigliatrice di tessuto e utilizzare un pestello di vetro sciolto per triturare il tessuto con una leggera forza meccanica. Successivamente, trasferire la sospensione del tessuto in un piatto di coltura cellulare e aggiungere PBS ghiacciato fino a sei millilitri.
Agitare rapidamente il piatto in modo che il liquido copra il fondo del piatto in modo uniforme. Incrociare la sospensione sul ghiaccio tre volte con 400 millijoule per centimetro squadrato a 254 nanometri. Assicurarsi di mescolare la sospensione tra ogni irradiazione.
Quindi, raccogliere la sospensione in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 1.200 volte g e a quattro gradi per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di PBS. Successivamente, trasferire la sospensione in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri.
Centrifugare a 1.000 volte g e a quattro gradi Celsius per due minuti, e scartare il supernatante. In primo luogo, aggiungere 125 microlitri di proteine A perline magnetiche per campione a un tubo di centrifuga fresco. Posizionare il tubo sul magnete per separare le perline dalla soluzione.
Dopo 10 secondi, rimuovere il supernatante e lavare le perline due volte con un millilitro di tampone di lysis ghiacciato. Rimescolare le perline in 100 microlitri di tampone di lysis fredda con 10 microgrammi di anticorpo eCLIP. Ruotare i tubi a temperatura ambiente per 45 minuti.
Quindi, lavare le perline due volte con un millilitro di tampone di lisi ghiacciata. Per iniziare, rimescolare il pellet di tessuto in un millilitro di tampone di lisi fredda contenente 22 microlitri di cocktail inibitore proteico privo di EDTA 50x e 11 microlitri di inibitore della RNasi. Continuare a lysing i campioni sul ghiaccio per 15 minuti.
Sonicare ogni campione come delineato nel protocollo di testo. Quindi, aggiungere quattro microlitri di DNasi a ciascun tubo e mescolare bene. Incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti tremando a 1.200 giri/min.
Dopodiché, aggiungere 10 microlitri di RNasi diluita e mescolare bene. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti tremando a 1.200 giri/min. Quindi, centrifuga a 15.000 volte g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti per cancellare il lisato.
Raccogliere con cura il supernatante e salvare campioni di input per campioni RWB e RRI. In primo luogo, aggiungere un millilitro del lysate alle perline preparate e ruotare i campioni a quattro gradi Celsius per due ore o durante la notte. Dopo questo, raccogli le perline con un supporto magnetico e scarta il supernatante.
Lavare le perline due volte con 900 microlitri di tampone ad alto sale, quindi lavare le perline due volte con 900 microlitri di tampone di lavaggio. Quindi, lavare le perline una volta con 500 microlitri di tampone di fosforilazione 1x. In primo luogo, scartare il supernatante e utilizzare punte di pipetta fine per rimuovere qualsiasi liquido residuo.
Aggiungere 25 microlitri di mix principale di ligation a tre primi a ciascun campione e pipettare con cura per mescolare. Aggiungere 2,5 microlitri di adattatore RNA X1A e 2,5 microlitri di adattatore RNA X1B a ciascun campione. Mescolare con cura pipettando o sfogliando.
Incubare a 25 gradi Celsius per 75 minuti, assicurandosi di scorrere il tubo per mescolare ogni 10 minuti. Lavare le perline una volta con 500 microlitri di tampone di lavaggio a freddo. Successivamente, lavare le perline una volta con 500 microlitri di tampone freddo ad alto sale e quindi con 500 microlitri di tampone di lavaggio a freddo.
Ripeti entrambi questi lavaggi ancora una volta. Separare magneticamente le perline e utilizzare punte di pipetta fine per rimuovere qualsiasi liquido residuo. Rimostrare le perline in 100 microlitri di tampone di lavaggio a freddo e spostare 20 microlitri in nuovi tubi come campioni di RWB.
Aggiungere 7,5 microlitri di tampone campione LDS 4x e tre microlitri di agente riducente del campione 10x ai campioni rimanenti. Incubare a 70 gradi Celsius per 10 minuti mentre si trema a 1.200 giri/min. Dopo questo, raffreddare i campioni sul ghiaccio per un minuto e centrifugare a 1.000 volte g e a quattro gradi Celsius per un minuto.
Per il gel RWB, posizionare i tubi su un magnete e separare l'eluito proteico dalle perline. Caricare 15 microlitri di campione in ogni pozzo. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di antiossidante a 500 millilitri di 1x tampone di funzionamento SDS.
Eseguire il gel a 200 volt, 1 tampone di funzionamento SDS per 50 minuti o fino a quando la parte anteriore del colorante è nella parte inferiore. Trasferire i complessi proteina-RNA dal gel a una membrana di nitrocellulosa a 10 volt per 70 minuti in tampone di trasferimento 1x con 10%metanolo. Bloccare la membrana RWB nel 5% di latte in TBST a temperatura ambiente per un'ora.
Risciacquare la membrana in TBST e incubare con anticorpi primari in TBST durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo questo, lavare due volte con TBST, con ogni lavaggio della durata di cinque minuti. Incubare con anticorpi secondari in TBST a temperatura ambiente per un'ora.
Quindi, lavare la membrana tre volte con TBST. Quindi, mescolare volumi uguali di tampone ECL A e tampone B.Aggiungere questa miscela alla membrana e incubare per un minuto. Coprire la membrana con un involucro di plastica ed esporla a una pellicola a raggi X a temperatura ambiente per due o tre minuti prima di sviluppare il film.
In questo studio, MOV10 eCLIP nei teste di topi adulti di tipo selvatico con RNasi I che tratta il lisato reticolato, la proteina bersaglio, che è di circa 114 kilodaltoni, viene arricchita con successo. I risultati qPCR del cDNA diluito uno a 10 da vari campioni rivelano che i campioni non collegati a croce mostrano una diminuzione del recupero dell'RNA. Si osserva che i valori Ct del gruppo non reticente sono generalmente cinque volte superiori al gruppo uv-crosslinked.
Qui sono riportati i risultati rappresentativi per l'amplificazione della PCR e la selezione delle dimensioni tramite elettroforesi del gel di agarosio. Il prodotto primer-dimer appare a circa 140 coppie di basi. La vista UCSC Genome Browser di due sequenze rappresentative di subclone mostra che i tag eCLIP associati a MOV10 si trovano all'interno dell'UTR a tre numeri primi del gene Fto.
Il tasso approssimativo di destinazioni UTR a tre numeri primi rappresenta il 75% è coerente con la maggior parte degli obiettivi MOV10 nelle celle HEK293 e nei teste. Al contrario, i tag eCLIP associati a MOV10L1 si trovano all'interno di un cluster di piRNA, indicando che MOV10L1 prende di mira i precursori di piRNA. Il tasso approssimativo di obiettivi precursori del piRNA rappresenta il 42% che riflette una tendenza degli studi precedenti.
MOV10L1 eCLIP con una digestione RNasi I da 40 unità per millilitro produce relativamente più sequenze con meno di 20 coppie di basi. Questo protocollo qui descritto rappresenta un impiego del metodo eCLIP nella riproduzione, un'area in cui la conoscenza dell'interazione RNA-RBP è piuttosto insufficiente.
