Les protéines liant l’ARN sont essentielles à la physiologie cellulaire. Fait important, le RBP sont fortement exprimés dans toute la spermatogenèse et ont été bien documentés comme régulateurs post-transcriptionnels essentiels à toutes les étapes des cellules germinales. L’identification de cibles contraignantes est essentielle pour élucider les rôles mécanistes de RBP.
Ce protocole représente une application adaptée de la méthode eCLIP pour capturer les cibles d’ARN direct endogène et établit une base applicable pour eCLIP chez les testicules mammifères. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle est non radioactive, moins gourmande en temps, et fournit un rapport signal-bruit plus fort parce que l’entrée appariée servira d’arrière-plan approprié pour les cibles authentiques. Enfin, nous pensons que le séquençage à petite échelle des sous-vêtements est utile pour suivre le séquençage profond.
Xu Qiushi, mon col lègue, démontrera la procédure. Pour commencer cette procédure, récoltez environ 100 milligrammes de testicules à partir de souris d’âge approprié pour chaque expérience d’immunoprécipitation. Placer les tissus dans du PBS glacé.
À l’aide d’une pince à épiler finement inclinée, retirer délicatement la tunica albuginea. Ajouter trois millilitres de PBS glacé à un broyeur de tissu, et utiliser un pilon en verre lâche pour triturer le tissu par une légère force mécanique. Ensuite, transférez la suspension tissulaire dans un plat de culture cellulaire et ajoutez du PBS glacé jusqu’à six millilitres.
Secouez l’assiette rapidement afin que le liquide recouvre uniformément le fond du plat. Reliez la suspension sur glace trois fois avec 400 millijoules par centimètre au carré à 254 nanomètres. Assurez-vous de mélanger la suspension entre chaque irradiation.
Ensuite, recueillir la suspension dans un tube conique de 15 millilitres, et centrifugeuse à 1200 fois g et à quatre degrés pendant cinq minutes. Retirez le supernatant et resuspendez la pastille en un millilitre de PBS. Après cela, transférez la suspension dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre.
Centrifugeuse à 1000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant deux minutes, et jeter le supernatant. Tout d’abord, ajouter 125 microlitres de protéines A perles magnétiques par échantillon à un tube de centrifugeuse fraîche. Placez le tube sur l’aimant pour séparer les perles de la solution.
Après 10 secondes, retirer le supernatant et laver les perles deux fois avec un millilitre de tampon de lyse glacée. Resuspendez les perles dans 100 microlitres de tampon de lyse froide avec 10 microgrammes d’anticorps eCLIP. Faire pivoter les tubes à température ambiante pendant 45 minutes.
Ensuite, lavez les perles deux fois avec un millilitre de tampon de lyse glacée. Pour commencer, resuspendez les granulés tissulaires dans un millilitre de tampon de lyse froide contenant 22 microlitres de 50 x cocktail inhibiteur des protéines sans EDTA et 11 microlitres d’inhibiteur de la RNase. Continuez à lyser les échantillons sur la glace pendant 15 minutes.
Sonicate chaque échantillon tel que décrit dans le protocole de texte. Ensuite, ajoutez quatre microlitres de DNase à chaque tube et mélangez bien. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes tout en secouant à 1200 rpm.
Après cela, ajouter 10 microlitres de RNase dilué et bien mélanger. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes tout en secouant à 1200 rpm. Puis, centrifugeuse à 15 000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes pour dégager le lysate.
Recueillir soigneusement le supernatant et enregistrer les échantillons d’entrée pour les échantillons de RWB et de RRI. Tout d’abord, ajouter un millilitre de lysate aux perles préparées, et faire pivoter les échantillons à quatre degrés Celsius pendant deux heures ou toute la nuit. Après cela, recueillir les perles avec un support magnétique, et jeter le surnatant.
Laver les perles deux fois avec 900 microlitres de tampon à haute teneur en sel, puis laver les perles deux fois avec 900 microlitres de tampon de lavage. Ensuite, lavez les perles une fois avec 500 microlitres de tampon de 1x dephosphorylation. Tout d’abord, jetez le supernatant, et utilisez des pointes de pipette fine pour enlever tout liquide résiduel.
Ajouter 25 microlitres de mélange maître de ligature à trois premiers à chaque échantillon, et soigneusement pipette à mélanger. Ajouter 2,5 microlitres d’adaptateur ARN X1A et 2,5 microlitres d’adaptateur ARN X1B à chaque échantillon. Mélanger soigneusement en pipetage ou en feuilletant.
Incuber à 25 degrés Celsius pendant 75 minutes, en s’assurant de faire glisser le tube pour mélanger toutes les 10 minutes. Lavez les perles une fois avec 500 microlitres de tampon de lavage à froid. Ensuite, lavez les perles une fois avec 500 microlitres de tampon froid à haute teneur en sel, puis avec 500 microlitres de tampon de lavage à froid.
Répétez ces deux lavages une fois de plus. Séparez magnétiquement les perles et utilisez des pointes de pipette fines pour éliminer tout liquide résiduel. Resuspendez les perles dans 100 microlitres de tampon de lavage à froid, et déplacez 20 microlitres vers de nouveaux tubes sous forme d’échantillons de RWB.
Ajouter 7,5 microlitres de tampon d’échantillon 4x LDS et trois microlitres d’agent réducteur d’échantillon 10x aux échantillons restants. Incuber à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes tout en secouant à 1200 rpm. Après cela, refroidir les échantillons sur la glace pendant une minute, et la centrifugeuse à 1000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant une minute.
Pour le gel RWB, placez les tubes sur un aimant et séparez l’élitate de protéines des perles. Chargez 15 microlitres d’échantillon dans chaque puits. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’antioxydant à 500 millilitres de tampon en cours d’exécution 1x SDS.
Faire fonctionner le gel à 200 volts, 1x SDS tampon en cours d’exécution pendant 50 minutes ou jusqu’à ce que l’avant de teinture est au fond. Transférer les complexes protéines-ARN du gel à une membrane de nitrocellulose à 10 volts pendant 70 minutes dans un tampon de transfert 1x avec 10% de méthanol. Bloquer la membrane RWB dans 5% de lait en TBST à température ambiante pendant une heure.
Rincer la membrane dans tbst, et incuber avec l’anticorps primaire dans TBST pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Après cela, laver deux fois avec tbst, avec chaque lavage d’une durée de cinq minutes. Incuber avec un anticorps secondaire dans tbst à température ambiante pendant une heure.
Ensuite, lavez la membrane trois fois avec tbst. Ensuite, mélanger des volumes égaux de tampon ECL A et tampon B.Ajouter ce mélange à la membrane, et incuber pendant une minute. Couvrez la membrane d’une pellicule plastique et exposez-la à un film à rayons X à température ambiante pendant deux à trois minutes avant de développer le film.
Dans cette étude, MOV10 eCLIP dans les testicules de souris adultes de type sauvage avec RNase I traitant le lysate croisé, la protéine cible, qui est d’environ 114 kilodaltons, est enrichi avec succès. Les résultats qPCR de cDNA dilués un à 10 de divers échantillons révèle que les échantillons non reliés entre eux montrent une diminution de la récupération de l’ARN. On observe que les valeurs Ct du groupe non relié entre les deux sont généralement cinq fois plus élevées que celles du groupe croisement uv.
Des résultats représentatifs pour l’amplification de PCR et la sélection de taille par l’électrophoresis de gel d’agarose sont montrés ici. Le produit d’amorce-dimère apparaît à environ 140 paires de base. La vue ucsc Genome Browser de deux séquences représentatives de sous-vêtements montre que les balises eCLIP liées à MOV10 se trouvent dans l’UTR à trois premiers du gène Fto.
Le taux approximatif d’objectifs UTR à trois premiers représente 75 % est conforme à la majorité des cibles MOV10 dans les cellules HEK293 et dans les testicules. En revanche, les étiquettes eCLIP liées à MOV10L1 se trouvent dans un cluster piRNA, indiquant que MOV10L1 cible les précurseurs de piRNA. Le taux approximatif de cibles précurseurs de l’ARN pi représente 42 %, ce qui reflète une tendance des études antérieures.
MOV10L1 eCLIP avec une digestion RNase I de 40 unités par millilitre donne relativement plus de séquences avec moins de 20 paires de base. Ce protocole décrit ici représente un emploi de la méthode eCLIP dans la reproduction, un domaine dans lequel les connaissances d’interaction ARN-RBP sont plutôt insuffisantes.
