RNA-bindende Proteine sind für die zelluläre Physiologie unerlässlich. Wichtig ist, dass die RBP in der Spermatogenese stark exprimiert sind und in allen Stadien der Keimzellen als wesentliche posttranskriptionelle Regulatoren gut dokumentiert wurden. Die Identifizierung verbindlicher Ziele ist entscheidend, um die mechanistische Rolle von RBP aufzuklären.
Dieses Protokoll stellt eine angepasste Anwendung der eCLIP-Methode zur Erfassung endogenes direkter RNA-Ziele dar und schafft eine anwendbare Grundlage für eCLIP in Säugetier-Hoden. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie nicht radioaktiv, weniger zeitintensiv und ein stärkeres Signal-Rausch-Verhältnis bietet, da der größengerechte Eingang als geeigneter Hintergrund für authentische Ziele dient. Schließlich sind wir der Meinung, dass die kleine Sequenzierung von Subklonen nützlich ist, um einer tiefen Sequenzierung zu folgen.
Der Beweis für das Verfahren wird Xu Qiushi sein, mein Kollege. Um dieses Verfahren zu beginnen, ernten Sie etwa 100 Milligramm Hoden von Mäusen des entsprechenden Alters für jedes Immunpräzipitationsexperiment. Legen Sie das Gewebe in eiskalteS PBS.
Entfernen Sie mit einer feingekippten Pinzette vorsichtig die Tunika albuginea. Fügen Sie drei Milliliter eiskaltes PBS zu einem Gewebeschleifer hinzu und verwenden Sie einen lockeren Glasschädling, um das Gewebe durch milde mechanische Kraft zu trituratieren. Als nächstes übertragen Sie die Gewebesuspension auf eine Zellkulturschale und fügen Sie eiskalte PBS bis zu sechs Milliliter hinzu.
Schütteln Sie die Platte schnell, so dass Flüssigkeit den Boden der Schale gleichmäßig bedeckt. Vernetzen Sie die Suspension auf Eis dreimal mit 400 Millijoule pro Zentimeter quadratisch bei 254 Nanometern. Achten Sie darauf, die Suspension zwischen jeder Bestrahlung zu mischen.
Dann sammeln Sie die Suspension in einem 15-Milliliter konischen Rohr, und Zentrifuge bei 1, 200 mal g und bei vier Grad für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS wieder auf. Danach die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr übertragen.
Zentrifugieren Sie bei 1 000 mal g und bei vier Grad Celsius für zwei Minuten, und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie zunächst 125 Mikroliter Protein A magnetische Perlen pro Probe zu einem frischen Zentrifugenrohr hinzu. Legen Sie das Rohr auf den Magneten, um die Perlen von der Lösung zu trennen.
Nach 10 Sekunden den Überstand entfernen und die Perlen zweimal mit einem Milliliter eiskalten Lysepuffer waschen. Setzen Sie die Perlen in 100 Mikroliter kalter Lysepuffer mit 10 Mikrogramm eCLIP-Antikörper aus. Drehen Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 45 Minuten.
Dann die Perlen zweimal mit einem Milliliter eiskalten Lysepuffer waschen. Zunächst sollten die Gewebepellets in einem Milliliter Kaltlysepuffer mit 22 Mikrolitern 50x EDTA-freier Proteininhibitor-Cocktail und 11 Mikroliter RNase-Inhibitor wieder ausgesetzt werden. Halten Sie die Proben auf Eis für 15 Minuten lysing.
Sonicatieren Sie jedes Beispiel wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes fügen Sie vier Mikroliter DNase zu jedem Rohr hinzu und mischen Sie sie gut. Bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren, während sie bei 1 200 Rpm schütteln.
Danach 10 Mikroliter verdünnte RNase hinzufügen und gut mischen. Bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren, während sie bei 1 200 Rpm schütteln. Dann Zentrifuge bei 15.000 mal g und bei vier Grad Celsius für 20 Minuten, um das Lysat zu löschen.
Sammeln Sie den Überstand sorgfältig und speichern Sie Eingabebeispiele für RWB- und RRI-Proben. Zuerst einen Milliliter des Lysats zu den vorbereiteten Perlen hinzufügen und die Proben bei vier Grad Celsius entweder zwei Stunden oder über Nacht drehen. Danach sammeln Sie die Perlen mit einem magnetischen Ständer und entsorgen Sie den Überstand.
Waschen Sie die Perlen zweimal mit 900 Mikroliter Hochsalzpuffer, und waschen Sie die Perlen dann zweimal mit 900 Mikroliter Waschpuffer. Dann waschen Sie die Perlen einmal mit 500 Mikroliter 1x Dephosphorylierungpuffer. Entsorgen Sie zunächst den Überstand, und verwenden Sie feine Pipettenspitzen, um Restflüssigkeit zu entfernen.
Fügen Sie 25 Mikroliter Drei-Prime-Ligation Master-Mix zu jeder Probe, und sorgfältig Pipette zu mischen. Fügen Sie 2,5 Mikroliter RNA-Adapter X1A und 2,5 Mikroliter RNA-Adapter X1B zu jeder Probe hinzu. Mischen Sie sorgfältig durch Pipettieren oder Flicken.
Inkubieren Sie bei 25 Grad Celsius für 75 Minuten, stellen Sie sicher, dass die Röhre alle 10 Minuten zu mischen. Waschen Sie die Perlen einmal mit 500 Mikroliter kaltwaschen den Puffer. Als nächstes die Perlen einmal mit 500 Mikroliter kaltem Hochsalzpuffer und dann mit 500 Mikroliter kalter Waschpuffer waschen.
Wiederholen Sie diese beiden Wassnochsungen. Magnetisch trennen Sie die Perlen, und verwenden Sie feine Pipettenspitzen, um Restflüssigkeit zu entfernen. Setzen Sie die Perlen in 100 Mikroliter Kaltwaschpuffer aus und bewegen Sie 20 Mikroliter als RWB-Proben in neue Röhren.
Fügen Sie 7,5 Mikroliter 4x LDS-Probenpuffer und drei Mikroliter 10x Probenreduktionsmittel zu den verbleibenden Proben hinzu. Bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren, während sie bei 1 200 Rpm schütteln. Danach die Proben auf Eis für eine Minute abkühlen und bei 1 000 mal g und bei vier Grad Celsius für eine Minute zentrieren.
Legen Sie bei RWB-Gel Die Röhrchen auf einen Magneten und trennen Sie Protein eluate von den Perlen. 15 Mikroliter Probe in jeden Brunnen laden. Als nächstes fügen Sie 500 Mikroliter Antioxidans zu 500 Millilitern des 1x SDS-Laufpuffers hinzu.
Führen Sie das Gel bei 200 Volt, 1x SDS-Laufpuffer für 50 Minuten oder bis die Farbstofffront an der Unterseite ist. Übertragen Sie die Protein-RNA-Komplexe vom Gel auf eine Nitrocellulosemembran bei 10 Volt für 70 Minuten im 1x Transferpuffer mit 10% Methanol. Blockieren Sie die RWB-Membran in 5%Milch in TBST bei Raumtemperatur für eine Stunde.
Spülen Sie die Membran in TBST und inkubieren Sie mit Primärantikörpern in TBST über Nacht bei vier Grad Celsius. Danach zweimal mit TBST waschen, wobei jede Wäsche fünf Minuten dauert. Mit Sekundärantikörper in TBST bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubieren.
Dann waschen Sie die Membran dreimal mit TBST. Als Nächstes mischen Sie gleiche Volumina von ECL-Puffer A und Puffer B.Add diese Mischung auf die Membran, und inkubieren für eine Minute. Bedecken Sie die Membran mit Plastikfolie und setzen Sie sie zwei bis drei Minuten lang einem Röntgenfilm bei Raumtemperatur aus.
In dieser Studie wird MOV10 eCLIP bei Hoden von erwachsenen Wildtypmäusen mit RNase I, die das vernetzte Lysat behandeln, das Zielprotein, das etwa 114 Kilodalton beträgt, erfolgreich angereichert. Die qPCR-Ergebnisse von cDNA verdünnt ein bis zehn aus verschiedenen Proben zeigt, dass nicht vernetzte Proben zeigen verringerte RNA-Recovery. Es wird beobachtet, dass die Ct-Werte der nicht vernetzten Gruppe im Allgemeinen fünfmal so hoch sind wie die UV-vernetzungen Gruppe.
Repräsentative Ergebnisse zur PCR-Verstärkung und Größenauswahl mittels Agarose-Gel-Elektrophorese sind hier dargestellt. Das Primer-Dimer-Produkt erscheint bei etwa 140 Basenpaaren. Die UCSC Genome Browser-Ansicht von zwei repräsentativen Subklonsequenzen zeigt, dass sich MOV10-gebundene eCLIP-Tags innerhalb der Drei-Prime-UTR des Gens Fto befinden.
Die ungefähre Rate der DREI-Prime-UTR-Ziele macht 75% aus und entspricht der Mehrheit der MOV10-Ziele in HEK293-Zellen und in Hoden. Im Gegensatz dazu befinden sich MOV10L1-gebundene eCLIP-Tags innerhalb eines piRNA-Clusters, was auf die Ziele von MOV10L1-Targets piRNA-Vorstufen hinweist. Die ungefähre Rate der piRNA-Vorläuferziele macht 42% aus, was einen Trend aus früheren Studien widerspiegelt.
MOV10L1 eCLIP mit einer 40-Einheiten-pro-Milliliter RNase I Verdauung ergibt relativ mehr Sequenzen mit weniger als 20 Basenpaaren. Dieses hier beschriebene Protokoll stellt eine Verwendung der eCLIP-Methode in der Reproduktion dar, ein Bereich, in dem das RNA-RBP-Interaktionswissen eher unzureichend ist.
