بروتوكولنا مهم ، لأنه يمكن استخدامه لإنشاء الفئران بشكل مستنسخ مع كل من ميكروبيوم الأمعاء البشرية وجهاز المناعة البشري. نحن ندعو هذه الفئران، فئران مزدوجة أنسانية. يمكن استخدام نموذج الفأر المزدوج الأنساني لكل من الأبحاث الطبية الحيوية الأساسية والترجمة ، بما في ذلك دراسة العلاقات في الجسم الحي بين ميكروبيوم الأمعاء البشرية وجهاز المناعة البشري.
وسوف يكون إثبات الإجراء جيانشوي تشانغ، وهو ما بعد الدكتوراه، ويلون تشانغ، وهو طالب دكتوراه من مختبرنا. لزرع أنسجة الكبد والغدة الصعترية في كبسولة الكلى اليسرى، أولاً، ضع الفأر في غطاء محرك السيارة. في يوم الجراحة ، علاج الفئران مع الجسم كله تحت أشعة تحت هاته في 12 centigrays لكل غرام من وزن الجسم جرعة.
حلق كل فأر حول الجانب الجانبي الأيسر و الجانب الوسيط بعد التأكد من مستوى مناسب من التخَدّم. ضع مرهم العيون على عيون الحيوان، وطبق علامة الأذن حسب الحاجة. تطهير الجلد مع ثلاثة اليود متتابعة و 70٪ الدعك isopropanol.
عندما تم إعداد الجلد، استخدم ملقط لتحميل واحد إلى واحد إلى ستة ملليمتر مكعبات جزء أنسجة الكبد الجنين الإنسان في trocar، تليها واحد إلى 1.6 ملليمتر مكعبات الجسم البشري جزء أنسجة الغدة الصعترية الجنينية. استخدام ملقط لرفع الجلد، واستخدام مشرط لجعل قطع طولية صغيرة في الجلد. تمديد القطع إلى 1.5 إلى اثنين من سنتيمتر على الجانب الأيسر من الماوس.
واستخدام ملقط لرفع طبقة العضلات. استخدام مقص لفتح طبقة العضلات طوليا، وتوسيع خفض حسب الضرورة لفضح الكلى، وفهم بلطف الأنسجة الدهنية المحيطة بالكلية. استخدم مشرطًا لإجراء شق من ملليمتر إلى ملليمترين في الطرف الخلفي من كبسولة الكلى وأدخل التروكر المُحمَّل مسبقًا ببطء في الشق الموازي للمحور الطويل للكلى.
حرر الأنسجة بين كبسولة الكلى والكلى، ثم ارجع الكلى والأمعاء إلى وضعها الطبيعي. ثم، استخدم الغرز لإغلاق طبقة العضلات والمواد الغذائية الجراحية لإغلاق الجلد. ضع الماوس في قفص ميكروسولاتر ذاتي مع المراقبة حتى الانكرامي الكامل.
بعد ست ساعات من الجراحة، ضع الفئران تحت مصباح الحرارة وطهر ذيول مع 70٪ isopropanol. حقن 1.5 إلى خمس مرات 10-5 CD34 إيجابية أنسجة الكبد الجنينية البشرية عزل الخلايا الجذعية hemopoietic في 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في واحد الوريد الذيل المتوسعة لكل. ثم وقف أي نزيف مع ضغط لطيف والعودة الفئران إلى قفص وطنهم.
بعد 9 إلى 12 أسابيع من الجراحة، استخدم ضبط النفس مشط البلاستيك الحجم المناسب لعزل ساق واحدة من الماوس أنيس، ورذاذ الجانب الوسط من الساق المعزولة مع 70٪ isopropanol. نشر المضادات الحيوية والمرهم تخفيف الألم على موقع جمع. باستخدام إبرة 25 قياس عقد في زاوية 90 درجة، ثقب الوريد الصابغ لجمع 50 إلى 100 ميكرولتر من الدم في أنبوب جمع الدم المغلفة EDTA.
عندما يتم الحصول على كمية مناسبة من الدم ، قم بالضغط على الموقع بقطعة شاش معقمة لوقف النزيف قبل إعادة الماوس إلى قفصه. ثم استخدم عينة الدم الطرفية التي تم جمعها لتقييم مستوى إعادة تشكيل الخلايا المناعية البشرية عن طريق قياس تدفق الخلايا باستخدام الأجسام المضادة ضد CD45 الإنسان، CD3، CD4، CD8، CD19 والفأر CD45. لجمع عينة البراز الطازجة، ضع أكياس الورق الأوتكاميد الفردية في غطاء أبخرة ووضع فأر واحد في كل كيس حتى كل يفرغ.
ثم العودة الفئران إلى قفصها، واستخدام ملقط العقيمة لنقل كل عينة البراز في أنبوب واحد 1.5 ملليلتر لكل ماوس لتخزين ناقص 80 درجة مئوية. في نهاية العلاج بالمضادات الحيوية لمدة 14 يومًا ، قم بتغيير مياه الشرب إلى المياه المعقمة المعقمة ، ونقل الفئران إلى قفص جديد. 24 و 48 ساعة بعد توقف المضادات الحيوية تذوب بشكل صحيح مصادر أعدت من مادة زرع الجراثيم البراز، و aliquot العينات في غرفة اللاهوائية في ظل الظروف اللاهوائية.
لإجراء عملية زرع البراز ، قم بتسليم 200 ميكرولترات من مواد زرع الميكروبات البرازية عبر القفاض الفموي إلى كل تجريبي ، ونشر أي مواد مذابة متبقية على فرو الفئران الإنسانية أو على فراش القفص. هنا، مثال على تحليل تدفق تحليل القياسات الدموية من الدم المحيطي من ماوس BLT أنسانية 10 أسابيع بعد الجراحة مبين. يمكن تحديد مجموعات الخلايا T و B على حد سواء، وكذلك مجموعات فرعية من الخلايا T الإيجابية CD4 و CD8.
في هذا الرسم البياني يمكن ملاحظة وفرة النسبية من عينات المانحة البراز الإنسان المستخدمة لنقل ميكروبيوم الأمعاء لخلق الفئران الأنيسة مزدوجة. التغيرات الظاهرية إلى الطحال وال cecum الناجمة عن العلاج بالمضادات الحيوية مماثلة لتلك التي لوحظت في الحيوانات الخالية من الجراثيم. هذه المؤامرة تحليل المكون الرئيسي من 16S التمثيل الحمض النووي الريبي 16s البيانات التسلسل يكشف أن الفئران الأنسانية مزدوجة لديها ميكروبيوم الأمعاء مثل الإنسان التي هي فريدة من نوعها لعينة المانحة البشرية.
الجانب الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو الحد من إدخال البكتيريا غير المرغوب فيها لضمان بقاء الفئران بصحة جيدة والحفاظ على ميكروبيوم الأمعاء البشرية. هذا النموذج لديه القدرة على تطوير الطب الشخصي والسماح لنا للنظر في كيفية تأثير الأمراض البشرية على ميكروبيوم الأمعاء مع السيطرة على العوامل المخففة الأخرى.
