הפרוטוקול שלנו הוא משמעותי, כי זה יכול להיות בשימוש כדי ליצור עכברים להתרבות עם מיקרוביום המעי האנושי ומערכת החיסון האנושית. אנחנו קוראים לעכברים האלה עכברים אנושיים כפולים. מודל העכבר האנושי הכפול יכול לשמש הן למחקר ביו-רפואי בסיסי והן למחקר ביו-רפואי תרגום, כולל חקר יחסי in vivo בין מיקרוביום המעי האנושי לבין המערכת החיסונית האנושית.
הדגמת ההליך תהיה ג'יאנשוי ג'אנג, פוסט-דוקטורט, וילון צ'אנג, דוקטורנט מהמעבדה שלנו. כדי להשתיל את רקמות הכבד והתימוס לתוך קפסולת הכליה השמאלית, ראשית, מניחים את העכבר במכסה המנוע. ביום הניתוח, לטפל בעכברים עם הקרנה sublethal כל הגוף ב 12 centigrays לגרם של מינון משקל הגוף.
לגלח כל עכבר סביב הצד הצדדי והמתווך השמאלי לאחר אישור רמה מתאימה של sedation. יש למרוח משחת עיניים על עיני החיה, ולהחיל תג אוזן לפי הצורך. לחטא את העור עם שלושה יוד רציף ו 70% isopropanol קרצוף.
כאשר העור כבר מוכן, להשתמש במטליות כדי לטעון אחד עד שישה מילימטר קוביות שבר רקמת כבד עוברי אנושי לתוך trocar, ואחריו אחד ל 1.6 מילימטר קוביות שבר רקמת התימוס האנושי העוברי. השתמש במקלות כדי להרים את העור, ולהשתמש אזמל לעשות חתך אורך קטן לתוך העור. הארך את החתך ל- 1.5 עד שני סנטימטרים בצד שמאל של העכבר.
ולהשתמש במדפים כדי להרים את שכבת השריר. השתמש מספריים כדי לפתוח את שכבת השריר אורך, הארכת החתך לפי הצורך כדי לחשוף את הכליה, בעדינות לתפוס את רקמת השומן המקיפה את הכליה. השתמש באזמל כדי לבצע חתך של 1-2 מילימטר בקצה האחורי של קפסולת הכליות ולהכניס לאט את trocar טעון מראש לתוך החתך במקביל לציר הארוך של הכליה.
שחררו את הרקמות בין קפסולת הכליות והכליות, והחזירו את הכליות והמעיים לתפקודם הרגיל. לאחר מכן, השתמש תפרים כדי לסגור את שכבת השריר סיכות כירורגיות כדי לסגור את העור. מניחים את העכבר לתוך כלוב מיקרוסולטור autoclaved עם ניטור עד שליטה מלאה.
שש שעות לאחר הניתוח, מניחים את העכברים תחת מנורת חום ומחטאים את הזנבות עם 70% isopropanol. להזריק 1.5 עד חמש פעמים 10-the-five CD34 רקמת כבד עוברית אנושית חיובית מבודדת תאי גזע המופויטיים ב 200 microliters של PBS לתוך וריד זנב אחד מוארך לכל בעל חיים. ואז לעצור כל דימום עם לחץ עדין ולהחזיר את העכברים לכלוב הבית שלהם.
תשעה עד 12 שבועות לאחר הניתוח, השתמשו באיפוק מסרק פלסטי בגודל מתאים כדי לבודד רגל אחת של עכבר אנושי אחד, וריסוס הצד המדיאלי של הרגל המבודדת עם 70% isopropanol. להפיץ משחה אנטיביוטית והקלה על כאבים באתר האוסף. באמצעות מחט 25-מד מוחזק בזווית של 90 מעלות, לנקב את הווריד saphenous לאסוף 50 עד 100 microliters של דם לתוך צינור איסוף דם מצופה EDTA.
כאשר הושג נפח מתאים של דם, להפעיל לחץ על האתר עם חתיכה סטרילית של גזה כדי לעצור את הדימום לפני החזרת העכבר לכלוב שלה. לאחר מכן השתמש בדגימת הדם ההיקפית שנאספה כדי להעריך את רמת התחדשות תאי החיסון האנושיים על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות נוגדנים נגד CD45 אנושי, CD3, CD4, CD8, CD19 ועכבר CD45. לאוסף מדגם צואה טרי, מניחים שקיות נייר אוטומטיות בודדות לתוך מכסה המנוע של האדים וממקמים עכבר אחד בכל שקית עד שכל בעל חיים עושה את צרכיו.
ואז להחזיר את העכברים לכלוב שלהם, ולהשתמש ממטרים סטריליים להעביר כל דגימת צואה לתוך צינור אחד 1.5 מיליליטר לכל עכבר עבור אחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס. בתום 14 יום של טיפול אנטיביוטי, לשנות את מי השתייה למים מעוכלים autoclaved, ולהעביר את העכברים לכלוב autoclaved חדש. 24 ו 48 שעות לאחר הפסקת אנטיביוטיקה להפשיר מקורות מוכנים כראוי של חומר השתלת מיקרוביוטה צואה, aliquot את הדגימות בתא אנאירובי בתנאים אנאירוביים.
כדי לבצע השתלת צואה, לספק 200 microliters של חומר השתלת מיקרוביוטה צואה באמצעות gavage אוראלי לכל חיה ניסיונית, ולהפיץ כל חומר מופשר שנותר על הפרווה של עכברים אנושיים או על מצעי הכלוב. כאן, דוגמה של ניתוח ציטומטריה זרימה של דם היקפי מעכבר BLT אנושי 10 שבועות לאחר הניתוח מוצג. ניתן לזהות אוכלוסיות תאים T ו- B, כמו גם ערכות משנה חיוביות של תאי T ו- CD8.
בגרף זה ניתן לראות את השפע היחסי של דגימות תורמי הצואה האנושיות המשמשות להעברת מיקרוביום במעיים כדי ליצור עכברים אנושיים כפולים. השינויים הפנוטיפיים בטח הטחול וההפסקה הנגרמים על ידי טיפול אנטיביוטי דומים לאלה שנצפו בבעלי חיים ללא חיידקים. עלילת ניתוח רכיבים עיקרית זו של נתוני ריצוף RNA ריבוזומלי 16S מייצגת מגלה שלעכברים אנושיים כפולים יש מיקרוביום מעיים דמוי אדם הייחודיים לדגימת התורם האנושי.
ההיבט הקריטי ביותר של פרוטוקול זה הוא להגביל את כניסתם של חיידקים לא רצויים כדי להבטיח שהעכברים יישארו בריאים וישמרו על מיקרוביום המעיים האנושי. מודל זה יש פוטנציאל לקדם רפואה מותאמת אישית ולאפשר לנו להסתכל איך המחלה האנושית משפיעה על המיקרוביום במעיים תוך שליטה על גורמים מקלים אחרים.
