Protokolümüz önemlidir, çünkü hem insan bağırsak mikrobiyomu hem de insan bağışıklık sistemi ile fareleri tekrartekrar oluşturmak için kullanılabilir. Biz bu farelere çift insanlaşmış fare diyoruz. Çift insanize fare modeli hem temel hem de çevirisel biyomedikal araştırma için kullanılabilir, insan bağırsak mikrobiyomu ve insan bağışıklık sistemi arasındaki in vivo ilişkilerinin çalışma da dahil olmak üzere.
Prosedürü gösteren Jianshui Zhang, bir postdoc ve Yilun Chang, bizim laboratuvardan doktora yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Sol böbrek kapsülü içine karaciğer ve timus dokuları implant için, ilk, bir başlık içinde fare yerleştirin. Ameliyat günü, vücut ağırlığı doz gram başına 12 centigrays tüm vücut sublethal ışınlama ile fareler tedavi.
Uygun bir sedasyon düzeyini doğruladıktan sonra her fareyi sol yan ve medial tarafın etrafında tıraş edin. Hayvanın gözlerine oftalmik merhem uygulayın ve gerektiğinde bir kulak etiketi uygulayın. Cildi üç sıralı iyot ve %70 isopropanol scrubs ile dezenfekte edin.
Deri hazırlandığında, bir ila altı milimetre küplü insan fetal karaciğer dokusu parçasını bir trokar içine yüklemek için forceps kullanın, bir-1.6 milimetre küplü insan fetal timus doku parçası takip. Cildi kaldırmak için forseps kullanın ve cilde küçük bir uzunlamasına kesim yapmak için bir neşter kullanın. Kesme yi farenin sol tarafında 1,5 ila iki santimetreye kadar uzatın.
Ve kas tabakasını kaldırmak için forseps kullanın. Kas tabakasını uzunlamasına açmak için makas kullanın, böbreği ortaya çıkarmak için gerekli olan kesiği genişletin ve böbreği çevreleyen yağ dokusunu nazikçe tutun. Böbrek kapsülünün arka ucunda bir-iki milimetrelik bir kesi yapmak için neşter kullanın ve önceden yüklenmiş trocar'ı böbreğin uzun eksenine paralel olarak yavaş yavaş kesiye takın.
Böbrek kapsülü ve böbrek arasındaki dokuları serbest bırakın ve böbrek ve bağırsak normal konumlarına dönmek. Sonra, kas tabakası ve cerrahi zımba cilt kapatmak için kapatmak için dikiş kullanın. Fareyi tam bir işe dönüşene kadar izleyerek otoklavlı bir mikroisolatör kafesine yerleştirin.
Ameliyattan altı saat sonra fareleri ısı lambasının altına yerleştirin ve kuyrukları %70 isopropanol ile dezenfekte edin. Enjekte 1.5-beş kez 10-beş-beş CD34 pozitif insan fetal karaciğer dokusu izole hemopoietic kök hücreleri 200 mikrolitre PBS hayvan başına bir dilate kuyruk damar içine. Sonra nazik basınç ile herhangi bir kanama durdurmak ve ev kafesi fareler dönmek.
Ameliyattan dokuz ila 12 hafta sonra, insanlaşmış bir farenin bir bacağını izole etmek için uygun büyüklükte plastik tarak kısıtlaması kullanın ve izole bacağın medial tarafını %70 izopropanol ile püskürtün. Toplama sitesine antibiyotik ve ağrı giderici merhem yayın. 90 derecelik açıda tutulan 25 kalibrelik bir iğneyi kullanarak, safenöz damarı delerek EDTA kaplı bir kan toplama tüpüne 50 ila 100 mikrolitre kan toplayın.
Uygun miktarda kan elde edildiğinde, fareyi kafesine geri vermeden önce kanamayı durdurmak için steril bir gazlı bez parçası yla bölgeye basınç uygulayın. Daha sonra insan CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 ve fare CD45 karşı antikorlar kullanarak akış sitometri tarafından insan bağışıklık hücresi reconstitution düzeyini değerlendirmek için toplanan periferik kan örneği kullanın. Taze dışkı örnek toplama için, bir duman başlık içine ayrı otoklavlı kağıt torbalar yerleştirin ve her hayvan dışkı kadar her çanta içine bir fare yerleştirin.
Daha sonra fareleri kafeslerine geri verin ve her dışkı örneğini fare başına eksi 80 santigrat derece depolama için 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmak için steril forsepskullanın. 14 günlük antibiyotik tedavisinin sonunda, içme suyunu sterilize edilmiş suya dönüştürün ve fareleri yeni bir otoklavlı kafese aktarın. Antibiyotiklerin kesilmesinden 24 ve 48 saat sonra fekal mikrobiyota nakli materyalinin düzgün bir şekilde hazırlanmış kaynakları çözülür ve anaerobik koşullarda anaerobik odada numuneleri aliquot.
Bir dışkı nakli gerçekleştirmek için, her deneysel hayvan oral gavaj yoluyla dışkı mikrobiyota nakli malzeme 200 mikrolitre teslim ve insanlaşmış farelerin kürk veya kafes yatak üzerine kalan çözülmüş malzeme yayıldı. Burada insanlaşmış BLT faresinden periferik kanın akış sitometri analizine bir örnek 10 hafta sonra ameliyat gösterilmiştir. T ve B hücre popülasyonları, CD4 ve CD8 pozitif T hücreleri alt kümeleri olarak tanımlanabilir.
Bu grafikte insandışkısı örneklerinin göreceli bolluğu, çift insanlaşmış fareler oluşturmak için bir bağırsak mikrobiyomu aktarmak için kullanılır. Antibiyotik tedavisi ile indüklenen dalak ve çekumdaki henotik değişiklikler mikropsuz hayvanlarda görülene benzer. Temsili 16S ribozomal RNA sıralama verilerinin bu ana bileşen analiz konusu, çift insanlaştırılmış farelerin insan donör örneğine özgü insanbenzeri bağırsak mikrobiyomlarına sahip olduğunu ortaya koymaktadır.
Bu protokolün en kritik yönü farelersağlıklı kalmasını sağlamak ve insan bağırsak mikrobiyom korumak için istenmeyen bakterilerin giriş sınırlamaktır. Bu model kişiselleştirilmiş tıp ilerlemek ve bize insan hastalığı diğer azaltıcı faktörler için kontrol ederken bağırsak mikrobiyomu nasıl etkilediğini bakmak için izin potansiyeline sahiptir.
