私たちのプロトコルは、ヒトの腸内微生物叢とヒト免疫系の両方を持つマウスを再現的に作成するために使用できるため、重要です。我々は、これらのマウス、二重ヒト化マウスと呼ぶ。二重ヒト化マウスモデルは、ヒト腸内微生物叢とヒト免疫系との生体内関係の研究を含む、基礎的および翻訳的な生物医学研究の両方に使用することができる。
この手順のデモンストレーションは、ポスドクの建水張と、私たちの研究室の博士課程の学生であるYilun Changです。肝臓と胸腺組織を左腎カプセルに移植するには、まず、マウスをフードに入れる。手術当日、体重量1グラム当たり12センチグレイで全身致死的な致死性照射でマウスを治療する。
適切なレベルの沈下を確認した後、左横側と内側側の周りに各マウスを剃ります。眼用軟膏を動物の目に塗布し、必要に応じて耳札を付けます。3つのシーケンシャルヨウ素と70%イソプロパノールスクラブで皮膚を消毒します。
皮膚が準備されたら、鉗子を使用して1〜6ミリメートル立方体のヒト胎児肝臓組織断片をトロカールにロードし、続いて1〜1.6ミリメートル立方体のヒト胎児胸腺組織断片をロードする。鉗子を使用して皮膚を持ち上げ、メスを使って皮膚に小さな縦方向に切り込ませます。カットをマウスの左側の 1.5 ~ 2 センチメートルまで伸ばします。
そして、筋肉層を持ち上げるために鉗子を使用してください。はさみを使って筋肉層を縦方向に開き、必要に応じて切り傷を伸ばして腎臓を露出させ、腎臓を取り巻く脂肪組織を優しくつかまえる。メスを使用して、腎臓カプセルの後端で1〜2ミリメートルの切開を行い、腎臓の長い軸に平行な切開部にプリロードされたトロカールをゆっくりと挿入します。
腎臓カプセルと腎臓の間の組織を解放し、腎臓と腸を正常な位置に戻す。次に、縫合糸を使用して筋肉層を閉じ、外科用ステープルを使用して皮膚を閉じます。完全な再収限まで監視とオートクレーブミオゾレーターケージにマウスを置きます.
手術の6時間後、マウスをヒートランプの下に置き、70%イソプロパノールで尾部を消毒する。PBSの200マイクロリットルで10〜5倍のヒト胎児肝臓組織を1.5〜5倍に10〜5回注入し、動物1匹につき1つの拡張された尾静脈にPBSを1回注入する。その後、穏やかな圧力で出血を停止し、マウスを自宅のケージに戻します。
手術後9~12週間、適当なサイズのプラスチック製の櫛の拘束を使用して、1本のヒト化マウスの片足を分離し、分離された脚の内側側に70%イソプロパノールを噴霧する。抗生物質と痛みを和らげる軟膏をコレクションサイトに広げます。90度の角度で保持された25ゲージの針を使用して、サペヌス静脈を穿刺して50〜100マイクロリットルの血液をEDTAコーティングされた採血管に集める。
適切な量の血液が得られた場合は、マウスをケージに戻す前に出血を止めるために、無菌のガーゼで部位に圧力をかける。次に、採取した末梢血サンプルを用いて、ヒトCD45、CD3、CD4、CD8、CD8、マウスCD45に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによるヒト免疫細胞再構成のレベルを評価する。新鮮な便のサンプルコレクションの場合は、個々のオートクレーブされた紙袋をヒュームフードに入れ、各動物が排便するまで各袋にマウスを1匹入れます。
その後、マウスをケージに戻し、滅菌鉗子を使用して各便サンプルをマウスあたり1.5ミリリットルのチューブに移し、マイナス80°Cの貯蔵を行います。14日間の抗生物質治療の終わりに、飲料水をオートクレーブ殺菌水に変更し、マウスを新しいオートクレーブケージに移します。抗生物質の停止後24時間および48時間後、便微小生物移植材料の供給源を適切に解凍し、嫌気性条件下で嫌気室内のサンプルをアリコートした。
便移植を行うために、各実験動物に経口ギャバジを介して200マイクロリットルの便微生物叢移植材料を送達し、残りの解凍物をヒト化マウスの毛皮またはケージ寝具に広める。ここでは、手術後10週目のヒト化BLTマウスからの末梢血のフローサイトメトリー解析の例を示す。T細胞とB細胞集団の両方を同定できるほか、CD4およびCD8陽性T細胞もサブセット化することができる。
このグラフでは、腸内微生物叢を移して二重ヒト化マウスを作り出すために使用されるヒト便ドナーサンプルの相対的な存在量が観察できる。抗生物質治療によって誘発される脾臓および盲腸へのフェロチの変化は、無菌動物で観察されるのと同様である。代表的な16SリボソームRNAシーケンシングデータの主成分分析プロットは、二重ヒト化マウスがヒトドナーサンプルに特有のヒト様腸内微生物叢を有することを明らかにした。
このプロトコルの最も重要な側面は、マウスが健康であり、ヒトの腸内微生物叢を維持することを確実にするために、不要な細菌の導入を制限することです。このモデルは、パーソナライズされた医療を進め、人間の病気が腸内微生物叢にどのような影響を与えるかを見て、他の緩和要因を制御する可能性を秘めています。
