Nosso protocolo é significativo, porque pode ser usado para criar camundongos reproduzivelmente com um microbioma intestinal humano e um sistema imunológico humano. Chamamos esses ratos, ratos humanizados duplos. O modelo de camundongo humanizado duplo pode ser usado para pesquisas biomédicas básicas e translacionais, incluindo o estudo das relações in vivo entre o microbioma intestinal humano e o sistema imunológico humano.
Demonstrando o procedimento estarão Jianshui Zhang, um pós-doutor, e Yilun Chang, um estudante de doutorado do nosso laboratório. Para implantar os tecidos de fígado e timo na cápsula renal esquerda, primeiro, coloque o rato em um capuz. No dia da cirurgia, trate os camundongos com irradiação subletal corporal inteira a 12 centímetros por grama de dose de peso corporal.
Raspe cada rato ao redor do lado lateral esquerdo e do lado medial após confirmar um nível apropriado de sedação. Aplique pomada oftálmica nos olhos do animal e aplique uma etiqueta de ouvido conforme necessário. Desinfete a pele com três iodo sequenciais e 70% de esfoliantes isopropanol.
Quando a pele estiver preparada, use fórceps para carregar um a seis milímetros de tecido hepático fetal humano em um trocarte, seguido por um fragmento de tecido de timo fetal humano de um a 1,6 milímetros. Use as fórceps para levantar a pele, e use um bisturi para fazer um pequeno corte longitudinal na pele. Estenda o corte para 1,5 a dois centímetros no lado esquerdo do mouse.
E use fórceps para levantar a camada muscular. Use a tesoura para abrir a camada muscular longitudinalmente, estendendo o corte conforme necessário para expor o rim, e segure suavemente o tecido gorduroso ao redor do rim. Use um bisturi para fazer uma incisão de um a dois milímetros na extremidade posterior da cápsula renal e insira lentamente o trocarte pré-carregado na incisão paralela ao longo eixo do rim.
Libere os tecidos entre a cápsula renal e o rim, e devolva o rim e o intestino às suas posições normais. Em seguida, use suturas para fechar a camada muscular e grampos cirúrgicos para fechar a pele. Coloque o mouse em uma gaiola de microisolador autoclavado com monitoramento até a recumbação total.
Seis horas após a cirurgia, coloque os ratos sob uma lâmpada de calor e desinfete as caudas com isopropanol de 70%. Injete de 1,5 a cinco vezes 10 a 5 cd34 tecido hepático fetal humano positivo isolado células-tronco hemopoiéticas em 200 microliters de PBS em uma veia traseira dilatada por animal. Em seguida, pare qualquer sangramento com pressão suave e devolva os ratos para sua gaiola.
Nove a 12 semanas após a cirurgia, use uma contenção de pente de plástico de tamanho apropriado para isolar uma perna de um rato humanizado, e pulverizar o lado medial da perna isolada com isopropanol de 70%. Espalhe antibiótico e pomada para aliviar a dor no local da coleta. Usando uma agulha de calibre 25 presa em um ângulo de 90 graus, puna a veia safena para coletar de 50 a 100 microliters de sangue em um tubo de coleta de sangue revestido de EDTA.
Quando um volume adequado de sangue tiver sido obtido, aplique pressão no local com um pedaço de gaze estéril para parar o sangramento antes de devolver o rato à sua gaiola. Em seguida, use a amostra de sangue periférica coletada para avaliar o nível de reconstituição de células imunes humanas por citometria de fluxo usando anticorpos contra CD45 humanos, CD3, CD4, CD8, CD19 e mouse CD45. Para a coleta de amostras fecais frescas, coloque sacos de papel autoclaved individuais em um capô de fumaça e coloque um rato em cada saco até que cada animal defeque.
Em seguida, devolva os ratos à sua gaiola, e use fórceps estéreis para transferir cada amostra fecal em um tubo de 1,5 mililitro por rato para menos 80 graus Celsius de armazenamento. No final do tratamento antibiótico de 14 dias, mude a água potável para água esterilizada autoclavada, e transfira os ratos para uma nova gaiola autoclavada. 24 e 48 horas após a cessação dos antibióticos descongelam fontes devidamente preparadas de material de transplante de microbiota fecal, e alíquotam as amostras em uma câmara anaeróbica sob condições anaeróbicas.
Para realizar um transplante fecal, entregue 200 microliters de material de transplante de microbiota fecal via gavage oral para cada animal experimental, e espalhe qualquer material descongelado restante na pele de camundongos humanizados ou na cama da gaiola. Aqui, um exemplo de análise de citometria de fluxo de sangue periférico de um rato BLT humanizado 10 semanas após a cirurgia é mostrado. As populações de células T e B podem ser identificadas, assim como subconjuntos de células T nD4 e CD8 positivos.
Neste gráfico pode ser observada a abundância relativa das amostras de doadores fecais humanos usadas para transferir um microbioma intestinal para criar camundongos humanizados duplos. As alterações fenotípicas no baço e no ceco induzidos pelo tratamento antibiótico são semelhantes às observadas em animais livres de germes. Este enredo principal de análise de componentes dos dados representativos de sequenciamento de RNA ribossômicos 16S revela que camundongos humanizados duplos têm microbiomas intestinais semelhantes a humanos que são exclusivos da amostra de doadores humanos.
O aspecto mais crítico deste protocolo é limitar a introdução de bactérias indesejadas para garantir que os camundongos permaneçam saudáveis e mantenham o microbioma intestinal humano. Esse modelo tem o potencial de avançar na medicina personalizada e nos permitir ver como a doença humana impacta o microbioma intestinal enquanto controla outros fatores mitigadores.
