Unser Protokoll ist von Bedeutung, da es verwendet werden kann, um Mäuse mit einem menschlichen Darmmikrobiom und einem menschlichen Immunsystem reproduzierbar zu erstellen. Wir nennen diese Mäuse doppelt humanisierte Mäuse. Das doppelhumanisierte Mausmodell kann sowohl für die grundlegende als auch für die translationale biomedizinische Forschung verwendet werden, einschließlich der Untersuchung von In-vivo-Beziehungen zwischen dem menschlichen Darmmikrobiom und dem menschlichen Immunsystem.
Demonstriert wird das Verfahren von Jianshui Zhang, einem Postdoc, und Yilun Chang, einem Doktoranden aus unserem Labor. Um leber- und Thymusgewebe in die linke Nierenkapsel zu implantieren, legen Sie zuerst die Maus in eine Kapuze. Behandeln Sie die Mäuse am Tag der Operation mit einer subletalen Bestrahlung des Ganzen Körpers mit einer Dosis von 12 Centigrays pro Gramm Körpergewicht.
Rasieren Sie jede Maus um die linke seitliche und mediale Seite, nachdem Sie eine entsprechende Sedierung sedierung sediert haben. Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen des Tieres auf und tragen Sie bei Bedarf eine Ohrmarke auf. Desinfizieren Sie die Haut mit drei aufeinanderfolgenden Jod- und 70%Isopropanolpeelings.
Wenn die Haut vorbereitet wurde, verwenden Sie Zangen, um ein bis sechs Millimeter gewürfeltes menschliches fetales Lebergewebefragment in einen Trokar zu laden, gefolgt von einem ein- bis 1,6 Millimeter gewürfelten menschlichen fetalen Thymus-Gewebefragment. Verwenden Sie die Zange, um die Haut zu heben, und verwenden Sie ein Skalpell, um eine kleine Längsschnitt in die Haut zu machen. Erweitern Sie den Schnitt auf 1,5 bis zwei Zentimeter auf der linken Seite der Maus.
Und verwenden Sie Zangen, um die Muskelschicht zu heben. Verwenden Sie eine Schere, um die Muskelschicht längs zu öffnen, den Schnitt nach Bedarf zu verlängern, um die Niere freizulegen, und greifen Sie vorsichtig das Fettgewebe, das die Niere umgibt. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Ein- bis zwei Millimeter Schnitt am hinteren Ende der Nierenkapsel zu machen und setzen Sie den vorbelasteten Trokar langsam parallel zur langen Achse der Niere in den Schnitt ein.
Lassen Sie das Gewebe zwischen Nierenkapsel und Niere frei und bringen Sie die Niere und den Darm in ihre normale Position zurück. Verwenden Sie dann Nähte, um die Muskelschicht und chirurgische Klammern zu schließen, um die Haut zu schließen. Legen Sie die Maus in einen autoklavierten Mikroisolatorkäfig mit Überwachung bis zur vollen Recumbumanz.
Sechs Stunden nach der Operation die Mäuse unter eine Wärmelampe stellen und die Schwänze mit 70% Isopropanol desinfizieren. Injizieren Sie 1,5 bis fünf Mal 10-zu-die-fünf CD34-positive menschliche fetale Lebergewebe isoliert hämopoetischen Stammzellen in 200 Mikroliter PBS in eine erweiterte Schwanzvene pro Tier. Dann stoppen Sie alle Blutungen mit sanftem Druck und bringen Sie die Mäuse in ihren heimischen Käfig zurück.
Neun bis 12 Wochen nach der Operation verwenden Sie eine entsprechend große Kunststoffkamm-Rückhalteeinrichtung, um ein Bein einer humanisierten Maus zu isolieren, und sprühen Sie die mediale Seite des isolierten Beins mit 70% Isopropanol. Verbreiten Sie Antibiotika und schmerzlindernde Salbe auf die Sammelstelle. Mit einer 25-Spur-Nadel in einem 90-Grad-Winkel, punktieren Sie die saphenous Vene, um 50 bis 100 Mikroliter Blut in einem EDTA-beschichteten Blutentnahmeröhrchen zu sammeln.
Wenn ein geeignetes Blutvolumen erhalten wurde, drucke mit einem sterilen Stück Gaze auf die Stelle, um die Blutung zu stoppen, bevor die Maus in ihren Käfig zurückgebracht wird. Verwenden Sie dann die gesammelte periphere Blutprobe, um den Grad der rekonstitution der menschlichen Immunzellen durch Durchflusszytometrie mit Antikörpern gegen menschliche CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 und Maus-CD45 zu bewerten. Für die frische Fäkalienprobensammlung legen Sie einzelne autoklavierte Papiertüten in eine Dunstabzugshaube und legen Sie eine Maus in jede Tasche, bis jedes Tier entfände.
Dann kehren Sie die Mäuse in ihren Käfig zurück und verwenden Sie sterile Zangen, um jede Fäkalienprobe in eine 1,5-Milliliter-Röhre pro Maus für minus 80 Grad Celsius Lagerung zu übertragen. Am Ende der 14-tägigen Antibiotikabehandlung das Trinkwasser in autoklavisiertes sterilisiertes Wasser umstellen und die Mäuse in einen neuen autoklaven Käfig geben. 24 und 48 Stunden nach Beendigung der Antibiotika tauen ordnungsgemäß vorbereitete Quellen von fäkalem Mikrobiota-Transplantationsmaterial auf und aliquotieren die Proben in einer anaeroben Kammer unter anaeroben Bedingungen.
Um eine Fäkaltransplantation durchzuführen, liefern Sie 200 Mikroliter fäkales Mikrobiota-Transplantationsmaterial per Oral-Gavage an jedes Versuchstier und verteilen Sie das verbleibende aufgetaute Material auf dem Fell von humanisierten Mäusen oder auf die Käfigbetten. Hier wird ein Beispiel für die Durchflusszytometrieanalyse von peripherem Blut aus einer humanisierten BLT-Maus 10 Wochen nach der Operation gezeigt. T- und B-Zellpopulationen können sowohl identifiziert als auch CD4- und CD8-positive T-Zellen-Teilmengen identifiziert werden.
In diesem Diagramm kann die relative Häufigkeit der menschlichen Fäkalienspenderproben beobachtet werden, die verwendet werden, um ein Darmmikrobiom zu übertragen, um doppelt humanisierte Mäuse zu erstellen. Die phänotytypischen Veränderungen der Milz und des Cecums, die durch antibiotika-Behandlung induziert werden, ähneln denen, die bei keimfreien Tieren beobachtet werden. Diese Hauptkomponentenanalyse-Diagramm der repräsentativen 16S ribosomale RNA-Sequenzierung Daten zeigt, dass doppel humanisierte Mäuse haben humanähnliche Darmmikrobiome, die einzigartig für die menschliche Spenderprobe sind.
Der kritischste Aspekt dieses Protokolls ist es, die Einführung unerwünschter Bakterien zu begrenzen, um sicherzustellen, dass die Mäuse gesund bleiben und das menschliche Darmmikrobiom erhalten. Dieses Modell hat das Potenzial, die personalisierte Medizin voranzubringen und uns zu ermöglichen, zu sehen, wie menschliche Krankheiten das Darmmikrobiom beeinflussen, während wir andere mildernde Faktoren kontrollieren.
