يقدم هذا البروتوكول منصة تحمل علامة البيوتين لدراسة تفاعلات حمض البروتين النووي التي تثبت أنها قوية وموثوقة وفعالة وبأسعار معقولة. ويمكن استخدام نفس الدفعة من الأحماض النووية التي تحمل علامة البيوتين على مدى فترة طويلة من الزمن، مع الحفاظ على إمكانية إعادة إنتاج التجارب. وأخيراً، يمكن إجراء جميع عمليات الفحص التي تحمل علامة البيوتين الموصوفة هنا في غضون يوم واحد ولا تتطلب معدات خاصة.
وسوف يكون إثبات الإجراء لينا يو، الدراسات العليا من مختبرنا. إعداد MEIOB و MOV10 الانشاءات، وتحويلها إلى البكتيريا المناسبة. لاستخراج MEIOB، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة توزيعها في 20 ملليلتر من الفوسفات الجليد الباردة في Dulbecco المخزنة احتياطي المالحة، أو DPBS، العازلة.
سونيكات تعليق البكتيرية على الجليد. ثم، الطرد المركزي في 12،000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة، ونقل المابير إلى أنبوب جديد. قبل غسل الجلوتاثيون-سيباهروز الخرز، واحتضان لهم مع lysate في أربع درجات مئوية لمدة ساعتين.
الطرد المركزي الخليط في 750 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة ل بيليه الخرز. شطف الخرز مع 10 ملليلتر من الجليد البارد برنامج تلفزيوني ثماني مرات. ثم، إضافة ملليلتر واحد من عازلة elution، احتضان الخرز في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق، و elute الخرز عن طريق الطرد المركزي.
كرر elution ست مرات، وتجمع معا الكسور الستة. نقل البروتينات مُمَرِّح إلى فلتر الطرد المركزي، والتركيز عن طريق الطرد المركزي في 7، 500 مرة ز لحجم نهائي من 100 إلى 200 ميكرولترات. لاستخراج MOV10، قم بالتعبير عن البروتين في خلايا HEK293T و بيليه الخلايا وفقًا لاتجاهات المخطوطة.
Resuspend بيليه في ثلاثة ملليلتر من العازلة تحلل الخلية مع كامل EDTA خالية من كوكتيل مثبطات البروتياز، واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد. ثم، الطرد المركزي في أربع درجات مئوية. إعداد الخرز المغناطيسي المضادة العلم عن طريق غسلها مرتين مع K150 العازلة.
بعد الغسيل، resuspend الخرز في ملليلتر واحد من الجليد الباردة K150 العازلة واحتضان لهم لمدة دقيقتين في أربع درجات مئوية مع تناوب لطيف. جمع الخرز على المغناطيس ، وإزالة supernatant. إضافة الخرز إلى الخلية lysate، واحتضان في أربع درجات مئوية لمدة ساعتين.
غسل الخرز مع المخزن المؤقت K150 وفقا لاتجاهات المخطوطة، وإعادة تعليق الخرز في 300 ميكرولترات من العازلة ELUTION العلم. ضع الخرز على المغناطيس، وجمع الماخر مع البروتينات MOV10، وتحديد تركيز البروتين. إعداد oligonucleotides الحمض النووي الريبي عن طريق تمييع كل oligo إلى 20 ميكرومولار وحنها لتشكيل الدوببلينات RNA وفقا لاتجاهات المخطوطة.
بالنسبة لملبس الحركة الكهربائية MEIOB، أو EMSA، اخلط الكواشف وفقًا لاتجاهات المخطوطة. إضافة الماء لحجم التفاعل النهائي من 20 ميكرولترات. احتضان رد فعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، ثم إضافة 5x توقف العازلة.
بالنسبة لمحسب نشاط MOV10، اخلط الكواشف وفقًا لاتجاهات المخطوطة وأضف الماء لمجلد تفاعل نهائي يبلغ 20 ميكرولترات. احتضان التفاعل في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق و 30 دقيقة و 60 دقيقة ، ثم إضافة 5x توقف العازلة لوقف رد الفعل. ثم، وإعداد 20٪ هلام بوليكريلاميد الأصلي، وتحميل 20 إلى 25 ميكرولترات من كل عينة في كل بئر.
تشغيل الجل في 100 فولت على حمام الثلج حتى انتقلت علامة الأزرق بروموفينول إلى الربع السفلي من الجل. الأكريلاميد ضار وسام. من المهم التعامل معها مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
تفكيك لوحات هلام، وتقليم هلام عن طريق إزالة آبار التحميل والممرات غير المستخدمة. ضع الجل في المخزن المؤقت TBE 0.5x. قطع ورقة مرشح وغشاء النايلون إلى حجم الجل، قبل الرطب ورقة والغشاء، وتجميع كومة لنقل.
نقل العينات من الجل إلى الغشاء في جهاز كهروفيرت وشبه جاف في 90 ملليمتر لمدة 20 دقيقة. ثم، ربط العينات عن طريق تشعيع الغشاء في 120 ملليجول لكل سنتيمتر مربع لمدة 45 إلى 60 ثانية. للكشف عن chemiluminescence، تبدأ بإضافة 20 ملليلتر من العازلة سد على الغشاء واحتضانه لمدة 15 إلى 30 دقيقة في حين تهتز بلطف.
قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر بعناية، واستبدله بمخزن مؤقت مترافق/حظر. احتضان الغشاء مرة أخرى لمدة 15 دقيقة. اغسل الغشاء أربع مرات بينما يرتجف لمدة خمس دقائق لكل غسل.
ثم، إضافة 30 ملليلتر من العازلة توازن الركيزة إلى الغشاء، واحتضانه لمدة خمس دقائق في حين تهتز في 20 إلى 25 دورة في الدقيقة. تغطية كامل سطح الغشاء مع الركيزة حل العمل، واحتضان لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، مسح الغشاء في نظام التصوير chemiluminescent لمدة ثانية إلى ثلاث ثوان.
يمكن التحقق من تنقية بروتينات MEIOB A و C و E باستخدام التلطيخ الأزرق Coomassie وتحليل البقعة الغربية. تشير الأسهم الحمراء إلى مواقع بروتينات MEIOB المنقية. يمكن تصور تفاعلات MEIOB والحمض النووي الوحيد الذي تقطعت به السبل باستخدام EMSA.
ويلاحظ أن الربط والتنشق المعتمدين على التركيز. كما هو متوقع، فقط البرية من نوع MEIOB-A يتفاعل مع الحمض النووي في حين أن MEIOB-E متحولة و MEIOB-C لا. ويمكن أيضا ملاحظة التفاعلات من MEIOB ورنا واحد الذين تقطعت بهم السبل.
يظهر MEIOB من النوع البري الربط المعتمد على التركيز والنشاط exonuclease على الحمض النووي الريبي الوحيد الذي تقطعت به السبل. ومع ذلك، تشير المقارنة الكمية إلى أن MEIOB يربط الحمض النووي بكفاءة أعلى من الحمض النووي الريبي. تم التحقق من تنقية MOV10 مع تلطيخ Coomassie الأزرق ، وتم قياس نشاط الهزلاط للبروتين على دوبليكس RNA مع تراكم خمسة وزراء.
كما يزيد وقت رد الفعل، MOV10 الاسترخاء تدريجيا رنا مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل. للحد من تكلفة الفحص ، يمكن إجراء الكشف chemiluminescence إما مع تخفيف مزدوج من الكواشف الكشف عن أو مع الكواشف عصامي. البروتوكول الموصوف هنا استخدم بنجاح الأحماض النووية التي تحمل علامة البيوتين كركائز للمكابس الكيميائية الحيوية في المختبر مثل EMSA وللتفاعلات الأنزيمية التي لم تستخدم فيها البيوتين بشكل شائع.
