Dieses Protokoll bietet eine biotinmarkierte Plattform für die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen, die sich als robust, zuverlässig, effizient und erschwinglich erweist. Die gleiche Charge der biotinmarkierten Nukleinsäuren kann über einen langen Zeitraum verwendet werden, wobei die Reproduzierbarkeit von Experimenten erhalten bleibt. Schließlich können alle hier beschriebenen biotingekennzeichneten Assays innerhalb eines Tages durchgeführt werden und erfordern keine spezielle Ausrüstung.
Demonstriert wird das Verfahren von Lina Yu, einer Postgraduiertenin aus unserem Labor. Bereiten Sie MEIOB- und MOV10-Konstrukte vor und wandeln Sie sie in die entsprechenden Bakterien um. Um MEIOB zu extrahieren, pellet die Zellen über Zentrifugation und setzt sie in 20 Milliliter eiskalten Dulbecco Phosphat gepufferten Saline, oder DPBS, Puffer.
Beschallen Sie die bakterielle Suspension auf Eis. Dann zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.000 mal g und vier Grad Celsius für 15 Minuten, und übertragen Sie den Überstand auf ein frisches Rohr. Glutathion-Sepharose-Perlen vorwaschen und zwei Stunden lang mit dem Lysat bei vier Grad Celsius bebrüten.
Zentrifugieren Sie die Mischung bei 750 mal g und vier Grad Celsius für eine Minute, um die Perlen zu pellet. Spülen Sie die Perlen achtmal mit 10 Millilitern eiskaltem PBS ab. Dann fügen Sie einen Milliliter Elutionspuffer hinzu, brüten Sie die Perlen bei vier Grad Celsius für 10 Minuten und lüeten die Perlen per Zentrifugation.
Wiederholen Sie die Elution sechsmal, und bündeln Sie die sechs Fraktionen zusammen. Die eluierten Proteine in einen Zentrifugalfilter übertragen und durch Zentrifugation bei 7, 500 mal g bei einem Endvolumen von 100 bis 200 Mikrolitern konzentrieren. Um MOV10 zu extrahieren, drücken Sie das Protein in HEK293T-Zellen aus und pelletdien die Zellen gemäß den Manuskriptanweisungen.
Das Pellet in drei Milliliterzelllysepuffer mit komplettem EDTA-freiem Protease-Hemmer-Cocktail aussetzen und 30 Minuten auf Eis inkubieren. Dann zentrifugieren Sie das Lysat bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie Anti-FLAG-Magnetperlen vor, indem Sie sie zweimal mit K150-Puffer waschen.
Nach dem Waschen die Perlen in einem Milliliter eiskalten K150-Puffer wieder aufhängen und bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation zwei Minuten lang bebrüten. Sammeln Sie die Perlen auf einem Magneten, und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie die Perlen in die Zelle lysiert, und brüten bei vier Grad Celsius für zwei Stunden.
Waschen Sie die Perlen mit K150 Puffer nach den Manuskriptrichtungen, und setzen Sie die Perlen in 300 Mikroliter FLAG-Elutionspuffer wieder auf. Legen Sie die Perlen auf einen Magneten, sammeln Sie den Überstand mit den MOV10-Proteinen und bestimmen Sie die Proteinkonzentration. Bereiten Sie die RNA-Oligonukleotide vor, indem Sie jeden Oligo auf 20 Mikromolar verdünnen und sie dazu anglühen, RNA-Duplexe gemäß den Manuskriptanweisungen zu bilden.
Für den MEIOB elektrophoretic mobility shift assay,oder EMSA, mischen Sie die Reagenzien nach den Manuskriptrichtungen. Fügen Sie Wasser für ein endgültiges Reaktionsvolumen von 20 Mikroliterhinzuleinen hinzu. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 30 Minuten, und fügen Sie dann 5x Stop-Puffer hinzu.
Für den MOV10 Helicase-Aktivitätstest die Reagenzien nach den Manuskriptrichtungen mischen und Wasser für ein Endreaktionsvolumen von 20 Mikrolitern hinzufügen. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten, 30 Minuten und 60 Minuten, und fügen Sie dann 5x Stop-Puffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Dann bereiten Sie ein 20% natives Polyacrylamid-Gel zu und laden 20 bis 25 Mikroliter jeder Probe in jeden Brunnen.
Führen Sie das Gel bei 100 Volt auf einem Eisbad, bis der Bromphenol-Blaue Marker in das untere Viertel des Gels migriert ist. Acrylamid ist schädlich und giftig. Es ist wichtig, es mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung zu behandeln.
Zerlegen Sie die Gelplatten und trimmen Sie das Gel, indem Sie Ladebrunnen und ungenutzte Bahnen entfernen. Legen Sie das Gel in 0,5x TBE-Puffer. Schneiden Sie Filterpapier und Nylonmembran auf die Größe des Gels, befeuchten Sie das Papier und die Membran vor und montieren Sie den Stapel für die Übertragung.
Übertragen Sie die Proben vom Gel in einem halbtrockenen elektrophoretischen Gerät mit 90 Milliampere für 20 Minuten auf die Membran. Vernetzen Sie dann die Proben, indem Sie die Membran 45 bis 60 Sekunden lang mit 120 Millijoule pro Zentimeter quadratisch bestrahlen. Für die Chemilumineszenzerkennung beginnen Sie mit dem Hinzufügen von 20 Millilitern Sperrpuffer in der Membran und inkubieren Sie ihn für 15 bis 30 Minuten, während sie sanft schüttelt.
Entfernen Sie den Blockierungspuffer vorsichtig, und ersetzen Sie ihn durch einen Konjugat-/Blockierungspuffer. Inkubieren Sie die Membran erneut für 15 Minuten. Waschen Sie die Membran viermal, während Sie fünf Minuten pro Wäsche schütteln.
Dann 30 Milliliter Substrat-Gleichgewichtspuffer in die Membran geben und fünf Minuten lang bebrüten, während sie bei 20 bis 25 Rpm schüttelt. Bedecken Sie die gesamte Oberfläche der Membran mit Substrat-Arbeitslösung, und inkubieren Sie für fünf Minuten. Scannen Sie die Membran nach der Inkubation ein bis drei Sekunden lang in einem chemilumineszierenden Bildgebungssystem.
Die Reinigung der MEIOB-Proteine A, C und E kann mit Coomassie-Blaufärbung und Western-Blot-Analyse verifiziert werden. Die roten Pfeile zeigen die Positionen der gereinigten MEIOB-Proteine an. Wechselwirkungen von MEIOB und einsträngiger DNA können mit EMSA visualisiert werden.
Konzentrationsabhängige Bindung und Spaltung werden beobachtet. Wie erwartet interagiert nur der Wildtyp MEIOB-A mit der DNA, während die mutierten MEIOB-E und MEIOB-C dies nicht tun. Wechselwirkungen von MEIOB und einsträngiger RNA können ebenfalls beobachtet werden.
Wildtyp MEIOB zeigt konzentrationsabhängige Bindungs- und Exonukleaseaktivität auf einsträngiger RNA. Der quantitative Vergleich zeigt jedoch, dass MEIOB DNA mit einer höheren Effizienz als RNA bindet. Die Reinigung von MOV10 wurde mit Coomassie-Blaufärbung überprüft, und die Helicase-Aktivität des Proteins wurde an einem RNA-Duplex mit einem Fünf-Prim-Überhang gemessen.
Mit zunehmender Reaktionszeit entlädt MOV10 die doppelsträngige RNA nach und nach. Um die Kosten des Assays zu senken, kann die Chemilumineszenzdetektion entweder mit einer doppelten Verdünnung der Detektionskit-Reagenzien oder mit selbsthergestellten Reagenzien durchgeführt werden. Das hier beschriebene Protokoll verwendete erfolgreich biotinmarkierte Nukleinsäuren als Substrate für in vitro biochemische Assays wie EMSA und für enzymatische Reaktionen, bei denen Biotin nicht häufig verwendet wurde.
