פרוטוקול זה מציע פלטפורמה עם תווית ביוטין לחקר אינטראקציות חומצת גרעין החלבון המוכיחה עצמה כחזקה, אמינה, יעילה ובמחיר סביר. אותה אצווה של חומצות גרעין שכותרתו ביוטין ניתן להשתמש על פני תקופה ארוכה של זמן, שמירה על שכפול של ניסויים. לבסוף, כל בדיקות ביוטין שכותרתו המתוארות כאן יכול להתבצע בתוך יום ולא דורשים ציוד מיוחד.
הפגנת ההליך תהיה לינה יו, תואר שני מהמעבדה שלנו. הכינו מבנים MEIOB ו- MOV10, והפכו אותם לחיידקים המתאימים. כדי לחלץ MEIOB, גלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה ו resuspend אותם 20 מיליליטר של קרח קר פוספט של דולבקו אגף מלוחים, או DPBS, חוצץ.
Sonicate ההשעיה חיידקית על קרח. לאחר מכן, צנטריפוגה lysate ב 12, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, ולהעביר את supernatant לצינור טרי. טרום שטיפה חרוזים גלוטתיון-Sepharose, ולהדגיר אותם עם ליזאט בארבע מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
צנטריפוגה את התערובת ב 750 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת כדי גלולה את חרוזים. לשטוף את חרוזים עם 10 מיליליטר של PBS קר כקרח שמונה פעמים. לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ אלוטיון, דגירה חרוזים בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, וללטף את חרוזים באמצעות צנטריפוגה.
חזור על האלוטיון שש פעמים, ובריכה יחד את ששת השברים. מעבירים את החלבונים האלמותיים למסנן צנטריפוגלי, ומתרכזים בצנטריפוגה פי 7, 500 גרם לנפח סופי של 100 עד 200 מיקרוליטר. כדי לחלץ MOV10, לבטא את החלבון בתאי HEK293T ו גלולה התאים על פי הוראות כתב היד.
תן את גלולה בשלושה מיליליטר של חיץ תות תא עם קוקטייל מעכב פרוטאז מלא ללא EDTA, ודגירה במשך 30 דקות על קרח. לאחר מכן, צנטריפוגה ליט בארבע מעלות צלזיוס. הכינו חרוזים מגנטיים נגד דגל על ידי שטיפתם פעמיים עם חיץ K150.
לאחר הכביסה, תוכלו למפות את חרוזים במיליליטר אחד של חיץ K150 קר כקרח ולהדגור אותם במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין. לאסוף את חרוזים על מגנט, ולהסיר את supernatant. מוסיפים את חרוזים לתא lysate, ו דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
לשטוף את חרוזים עם חיץ K150 על פי הוראות כתב היד, ו resuspend את חרוזים 300 microliters של חיץ אלוטיון דגל. מניחים את חרוזים על מגנט, לאסוף את supernatant עם חלבוני MOV10, ולקבוע את ריכוז החלבון. הכן את אוליגונוקלאוטידים RNA על ידי דילול כל אוליגו ל 20 micromolar ו annealing אותם כדי ליצור דופלקסים RNA על פי הוראות כתב היד.
עבור מוצ"ש שינוי הניידות האלקטרופורטי של MEIOB, או EMSA, מערבבים את ריאגנטים בהתאם לכיווני כתב היד. מוסיפים מים לנפח תגובה סופי של 20 מיקרוליטרים. הדגירה את התגובה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, ולאחר מכן להוסיף חיץ עצירה 5x.
לצורך בדיקה של פעילות הליקס MOV10, מערבבים את ריאגנטים על פי הוראות כתב היד ומוסיפים מים לנפח תגובה סופי של 20 מיקרוליטרים. הדגירה את התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, 30 דקות, ו 60 דקות, ולאחר מכן להוסיף חיץ עצירה 5x כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, הכינו ג'ל פוליאקרילמיד מקורי של 20%, והעמיסו 20 עד 25 מיקרוליטרים של כל דגימה לתוך כל באר.
הפעל את הג'ל ב 100 וולט על אמבט קרח עד הסמן הכחול bromophenol עבר לרבע התחתון של הג'ל. אקרילאמיד מזיק ורעיל. חשוב לטפל בו עם ציוד מגן אישי מתאים.
לפרק את צלחות הג'ל, לקצץ את הג'ל על ידי הסרת בארות טעינה נתיבים שאינם שימוש. מניחים את הג'ל במאגר TBE 0.5x. חותכים נייר סינון וממברנה ניילון לגודל של הג'ל, מראש להרטיב את הנייר ואת הממברנה, ולהרכיב את הערימה להעברה.
מעבירים את הדגימות מהג'ל לממברנה במנגנונים אלקטרופורטיים יבשים למחצה ב-90 מיליאמפר למשך 20 דקות. לאחר מכן, לחצות את הדגימות על ידי הקרנת הממברנה ב 120 מיליליטר סנטימטר בריבוע במשך 45 עד 60 שניות. לגילוי chemiluminescence, להתחיל על ידי הוספת 20 מיליליטר של חיץ חסימה לממברנה דגירה זה במשך 15 עד 30 דקות תוך רעידות בעדינות.
הסר בזהירות את מאגר החסימה והחלף אותו במאגר תאוב/חסימה. דגירה הממברנה שוב במשך 15 דקות. לשטוף את הממברנה ארבע פעמים תוך כדי רעידות במשך חמש דקות לכל לשטוף.
לאחר מכן, מוסיפים 30 מיליליטר של חיץ שיווי משקל מצע לממברנה, ו דגירה אותו במשך חמש דקות תוך רועד ב 20 עד 25 סל"ד. מכסים את כל פני השטח של הממברנה בתת פתרון עבודה מצע, ו דגירה במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, סרוק את הממברנה במערכת הדמיה כימלומינסנטית למשך דקה עד שלוש שניות.
טיהור של חלבוני MEIOB A, C ו- E ניתן לאמת עם כתמים כחולים קומאסי וניתוח כתם מערבי. החצים האדומים מציינים את מיקומם של חלבוני MEIOB המטוהרים. אינטראקציות של MEIOB ו- DNA חד-גדילי ניתן לדמיין באמצעות EMSA.
כריכה תלוית ריכוז ומחשוף נצפו. כצפוי, רק MEIOB-A מסוג פראי אינטראקציה עם ה-DNA בעוד המוטנט MEIOB-E ו MEIOB-C לא. אינטראקציות של MEIOB ו- RNA חד-תקע ניתן גם לצפות.
MEIOB מסוג פראי מראה פעילות מחייבת ואקסונוקלאז תלוית ריכוז ב- RNA חד-תקע. עם זאת, השוואה כמותית מראה כי MEIOB קושר DNA ביעילות גבוהה יותר מאשר RNA. טיהור של MOV10 אומת עם כתמים כחולים קומאסי, ופעילות ההליקאז של החלבון נמדדה בדופלקס RNA עם אוברהאנג של חמישה ראשים.
ככל שזמן התגובה עולה, MOV10 מהשתחרר בהדרגה מה-RNA הדו-גדילי. כדי להפחית את עלות ההתמדה, זיהוי chemiluminescence יכול להתבצע עם דילול כפול של רייגנטים ערכת זיהוי או עם reagents תוצרת עצמית. הפרוטוקול המתואר כאן השתמש בהצלחה בחומצות גרעין המסומנים ביוטין כמצעים עבור מיסיונים ביוכימיים במבחנה כגון EMSA ולתגובות אנזימטיות שבהן ביוטין לא היה נפוץ.
