Este protocolo oferece uma plataforma rotulada por biotina para o estudo de interações proteína-nucleic ácido que se mostra robusta, confiável, eficiente e acessível. O mesmo lote dos ácidos nucleicos rotulados por biotina pode ser usado durante um longo período de tempo, mantendo a reprodutibilidade dos experimentos. Finalmente, todos os ensaios rotulados por biotina descritos aqui podem ser realizados dentro de um dia e não necessitam de equipamentos especiais.
Demonstrando o procedimento será Lina Yu, pós-graduada do nosso laboratório. Prepare as construções MEIOB e MOV10 e transforme-as nas bactérias apropriadas. Para extrair MEIOB, pelota as células através de centrifugação e resuspensá-las em 20 mililitros de fosfato de Dulbecco gelado tampão, ou DPBS, tampão.
Sonicar a suspensão bacteriana no gelo. Em seguida, centrifugar o lysate a 12.000 vezes g e quatro graus Celsius por 15 minutos, e transferir o sobrenante para um tubo fresco. Pré-lavar as contas de glutationa-sepharose e incubar-as com o lise a quatro graus Celsius por duas horas.
Centrifugar a mistura a 750 vezes g e quatro graus Celsius por um minuto para pelotar as contas. Enxágüe as contas com 10 mililitros de PBS gelado oito vezes. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de eluição, incuba as contas a quatro graus Celsius por 10 minutos, e elute as contas através de centrifugação.
Repita a eluição seis vezes, e misture as seis frações. Transfira as proteínas elucidadas em um filtro centrífuga, e concentre-se por centrifugação a 7.500 vezes g para um volume final de 100 a 200 microliters. Para extrair MOV10, expresse a proteína nas células HEK293T e pelota as células de acordo com as instruções do manuscrito.
Resuspenda a pelota em três mililitros de tampão de lise celular com coquetel inibidor completo de protease sem EDTA, e incubar por 30 minutos no gelo. Em seguida, centrifugar o lysate a quatro graus Celsius. Prepare contas magnéticas anti-FLAG lavando-as duas vezes com tampão K150.
Após a lavagem, resuspenja as contas em um mililitro de tampão K150 gelado e incuba-as por dois minutos a quatro graus Celsius com rotação suave. Colete as contas em um ímã, e remova o supernante. Adicione as contas ao lisetê celular e incubar a quatro graus Celsius por duas horas.
Lave as contas com tampão K150 de acordo com as instruções do manuscrito, e resuspenja as contas em 300 microliters de buffer de elução FLAG. Coloque as contas em um ímã, colete o supernasce com as proteínas MOV10 e determine a concentração de proteínas. Prepare os oligonucleotídeos de RNA diluindo cada oligo a 20 micromolares e ressarando-os para formar duplexes de RNA de acordo com as instruções do manuscrito.
Para o ensaio de mudança de mobilidade eletroforética DO MEIOB, ou EMSA, misture os reagentes de acordo com as instruções do manuscrito. Adicione água para um volume final de reação de 20 microliters. Incubar a reação à temperatura ambiente por 30 minutos e, em seguida, adicione 5x de buffer de parada.
Para o ensaio de atividade helicase MOV10, misture os reagentes de acordo com as instruções do manuscrito e adicione água para um volume final de reação de 20 microliters. Incubar a reação a 37 graus Celsius por 10 minutos, 30 minutos e 60 minutos, e depois adicionar 5x tampão de parada para parar a reação. Em seguida, prepare um gel de poliacrilamida 20% nativo e carregue de 20 a 25 microliters de cada amostra em cada poço.
Execute o gel a 100 volts em um banho de gelo até que o marcador azul bromofenol tenha migrado para o último quarto do gel. A crilamida é prejudicial e tóxica. É importante lidar com ele com equipamentos de proteção individual adequados.
Desmonte as placas de gel e corte o gel removendo poços de carga e pistas nãousadas. Coloque o gel em tampão TBE 0,5x. Corte o papel do filtro e a membrana de nylon do tamanho do gel, pré-molhe o papel e a membrana e monte a pilha para transferência.
Transfira as amostras do gel para a membrana em um aparelho eletroforético semi-seco a 90 miliamperes por 20 minutos. Em seguida, cruze as amostras irradiando a membrana a 120 milímetros por centímetro quadrado por 45 a 60 segundos. Para detecção de chemiluminescência, comece adicionando 20 mililitros de tampão de bloqueio à membrana e incubando-o por 15 a 30 minutos enquanto treme suavemente.
Remova cuidadosamente o buffer de bloqueio e substitua-o por um tampão conjugado/bloqueador. Incubar a membrana novamente por 15 minutos. Lave a membrana quatro vezes enquanto treme por cinco minutos por lavagem.
Em seguida, adicione 30 mililitros de tampão de equilíbrio de substrato à membrana, e incuba-o por cinco minutos enquanto treme a 20 a 25 rpm. Cubra toda a superfície da membrana com solução de trabalho de substrato e incuba por cinco minutos. Após a incubação, escaneie a membrana em um sistema de imagem quemiluminescente por um a três segundos.
A purificação das proteínas MEIOB A, C e E pode ser verificada com coloração azul Coomassie e análise de manchas ocidentais. As setas vermelhas indicam as posições das proteínas MEIOB purificadas. Interações de MEIOB e DNA mono-encalhado podem ser visualizadas usando EMSA.
A ligação dependente da concentração e o decote são observados. Como esperado, apenas o MEIOB-A do tipo selvagem interage com o DNA enquanto o mutante MEIOB-E e MEIOB-C não. Interações de MEIOB e RNA de fio único também podem ser observadas.
O MEIOB do tipo selvagem mostra a vinculação dependente da concentração e a atividade de exonuclease no RNA de uma única cadeia. No entanto, a comparação quantitativa mostra que o MEIOB liga o DNA com maior eficiência do que o RNA. A purificação do MOV10 foi verificada com coloração azul Coomassie, e a atividade helicase da proteína foi medida em um duplex de RNA com uma saliência de cinco primos.
À medida que o tempo de reação aumenta, o MOV10 desenrola progressivamente o RNA de duplar. Para reduzir o custo do ensaio, a detecção de quemiluminescência pode ser realizada com uma diluição dupla dos reagentes do kit de detecção ou com reagentes auto-fabricados. O protocolo descrito aqui usou com sucesso ácidos nucleicos rotulados com biotina como substratos para ensaios bioquímicos in vitro, como a EMSA e para reações enzimáticas nas quais a biotina não tem sido comumente usada.
