使用生物素标签研究蛋白质-核酸相互作用的体外生化分析

该协议为研究蛋白质-核酸相互作用提供了一个生物素标签平台，证明其稳健、可靠、高效且价格实惠。同一批生物素标记的核酸可以长期使用，保持实验的可重复性。最后，此处描述的所有生物素标记检测都可以在一天内进行，不需要特殊设备。

演示这个程序的将是来自我们实验室的研究生LinaYu。准备 MEIOB 和 MOV10 构造，并将其转换为适当的细菌。要提取 MEIOB，通过离心将细胞颗粒，然后重新在 20 毫升的冰冷的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（DPBS）缓冲液中重新填充。

声波的细菌悬浮液在冰上。然后，将12，000倍g和4摄氏度的利酸盐离心15分钟，然后将上分液转移到一个新鲜的管中。预洗谷胱甘肽-塞法罗斯珠，并在四摄氏度下用谷氨酸孵育两小时。

将混合物在750倍g和4摄氏度下离心一分钟，以分粒珠子。用10毫升的冰冷PBS冲洗珠子8次。然后，加入一毫升的洗脱缓冲液，在4摄氏度下孵育珠子10分钟，然后通过离心将珠子孵育。

重复洗脱六次，将六个分数汇集在一起。将洗出的蛋白质转移到离心过滤器中，以7，500倍g的离心浓缩，最终体积为100至200微升。要提取MOV10，在 HEK293T 细胞中表达蛋白质，然后根据手稿方向对细胞进行颗粒。

将颗粒重新吸收在三毫升细胞解液缓冲液中，并服用完整的无 EDTA 蛋白酶抑制剂鸡尾酒，并在冰上孵育 30 分钟。然后，在摄氏四度时将酸盐离心。使用 K150 缓冲液清洗两次防旗磁珠，准备防旗磁珠。

洗涤后，将珠子重新在一毫升冰冷的K150缓冲液中，在4摄氏度下温和旋转孵育两分钟。收集磁铁上的珠子，取出上一液。将珠子加入细胞酸盐，在四摄氏度下孵育两小时。

根据手稿方向用 K150 缓冲液清洗珠子，并在 FLAG 洗脱缓冲液的 300 微升中重新填充珠子。将珠子放在磁铁上，用MOV10蛋白收集上清液，并确定蛋白质浓度。准备RNA寡核苷酸，将每个寡糖稀释至20微摩尔，然后根据手稿指示将寡核苷酸退火，形成RNA双面体。

对于 MEIOB 电泳移动性移位测定（EMSA），请根据手稿指示混合试剂。加入水，最终反应量为20微升。在室温下孵育反应30分钟，然后加入5倍止损缓冲液。

对于MOV10直升机体活性测定，根据手稿说明混合试剂，并加入水，最终反应量为20微升。在37摄氏度下孵育反应10分钟、30分钟和60分钟，然后加入5倍停止缓冲液以阻止反应。然后，制备20%原生聚丙烯酰胺凝胶，将每个样品的20至25微升装入每个井中。

在冰浴上以 100 伏的电压运行凝胶，直到布罗莫酚蓝色标记迁移到凝胶的底部。丙烯酰胺是有害和有毒的。使用适当的个人防护设备进行处理非常重要。

拆解凝胶板，通过去除装载井和未使用的通道来修剪凝胶。将凝胶放在0.5x TBE缓冲液中。将滤纸和尼龙膜切割成凝胶大小，预先湿润纸张和膜，并组装堆栈进行转移。

将样品在90毫安的半干电泳装置中从凝胶转移到膜上20分钟。然后，将样品以每厘米120毫焦耳的平方照射，将样品交联45至60秒。对于化学发光检测，首先在膜中加入20毫升的阻尼缓冲液，并在轻轻摇动时孵育15至30分钟。

小心地删除阻塞缓冲区，并将其替换为偶联/阻塞缓冲区。再次孵育膜15分钟。每次洗涤时摇动五分钟，清洗膜四次。

然后，在膜中加入30毫升基板平衡缓冲液，在20至25转/时摇动时孵育5分钟。用基板工作溶液覆盖膜的整个表面，孵育五分钟。孵育后，在化学发光成像系统中扫描膜一至三秒钟。

通过库马西蓝色染色和西印迹分析，可以验证 MEIOB 蛋白 A、C 和 E 的纯化。红色箭头表示纯化的 MEIOB 蛋白的位置。MEIOB 和单链 DNA 的相互作用可以使用 EMSA 进行可视化。

观察到浓度依赖结合和裂解。不出所料，只有野生型 MEIOB-A 与 DNA 相互作用，而突变 MEIOB-E 和 MEIOB-C 则不与 DNA 相互作用。也可以观察到 MEIOB 和单链RNA的相互作用。

野生型 MEIOB 显示单链RNA上的浓度依赖结合和外核酶活性。然而，定量比较表明，MEIOB结合DNA的效率高于RNA。MOV10的纯化用库马西蓝色染色进行验证，在RNA双面体上测量了该蛋白的血体活性，其悬垂为5个。

随着反应时间的增加，MOV10 逐渐解除双链RNA。为了降低检测成本，化学致发光检测可以通过检测试剂试剂的两倍稀释或自制试剂进行。此处描述的协议成功地将生物素标记的核酸用作体外生化测定（如 EMSA）和未常用生物素的酶反应的基质。