Bu protokol, sağlam, güvenilir, verimli ve uygun fiyatlı olduğunu kanıtlayan protein-nükleik asit etkileşimlerinin incelenmesi için biotin etiketli bir platform sunmaktadır. Biyotin etiketli nükleik asitlerin aynı toplu deneylerin tekrarlanabilirliğini koruyarak, uzun bir süre boyunca kullanılabilir. Son olarak, burada açıklanan tüm biotin etiketli tahliller bir gün içinde yapılabilir ve özel ekipman gerektirmez.
Prosedürü gösteren Lina Yu, laboratuvarımızdan mezun olan bir lisansüstü gelecek. MEIOB ve MOV10 yapılarını hazırlayın ve uygun bakterilere dönüştürün. MEIOB ayıklamak için, santrifüj yoluyla hücreleri pelet ve buz gibi Dulbecco fosfat tamponlu salin, ya da DPBS, tampon 20 mililitre onları askıya.
Bakteriyel süspansiyonu buzda sonicate edin. Daha sonra 12, 000 kez g ve 4 santigrat derece 15 dakika boyunca lysate santrifüj ve taze bir tüp için supernatant aktarın. Glutatyon-Sepharose boncukları önceden yıkayın ve iki saat boyunca dört derece santigrat lysate ile kuluçkaya yatırın.
Karışımı 750 kez g ve 4 santigrat derecede bir dakika boyunca santrifüj edin ve boncukları peletleyin. Boncukları 10 mililitre buz gibi PBS ile sekiz kez durulayın. Daha sonra, bir mililitre elüsyon tamponu ekleyin, boncukları 10 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve santrifüj yoluyla boncukları azlayın.
Elüsyonu altı kez tekrarlayın ve altı kesirleri bir araya getirin. Eluted proteinleri bir santrifüj filtreye aktarın ve 100 ila 200 mikrolitrelik son hacim için 7, 500 kez g santrifüj ile konsantre olun. MOV10'u çıkarmak için HEK293T hücrelerindeki proteini ifade edin ve hücreleri el yazması talimatlara göre peletlendirin.
Tam EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyli ile hücre lisis tampon üç mililitre pelet resuspend, ve buz üzerinde 30 dakika kuluçka. Sonra, lysat'ı 4 santigrat derecede santrifüj edin. K150 tampon ile iki kez yıkayarak anti-FLAG manyetik boncuk hazırlayın.
Yıkamadan sonra, buz gibi K150 tampon bir mililitre boncuk yeniden askıya ve nazik rotasyon ile dört derece santigrat iki dakika kuluçka. Bir mıknatıs üzerinde boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Boncukları hücre lisatesine ekleyin ve dört santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın.
Boncukları el yazması yönlere göre K150 tamponuyla yıkayın ve boncukları 300 mikrolitre BAYRAK elüsyonu tamponunda yeniden askıya alın. Bir mıknatıs üzerine boncuk yerleştirin, MOV10 proteinleri ile supernatant toplamak ve protein konsantrasyonu belirlemek. Her oligoyu 20 mikromolar ile seyrelterek ve el yazması yönlere göre RNA dubleksleri oluşturmak için onları zorlayarak RNA oligonükleotidleri hazırlayın.
MEIOB elektroforetik hareketlilik değişim ilerderveya EMSA için reaktifleri el yazması talimatlara göre karıştırın. 20 mikrolitrelik son reaksiyon hacmi için su ekleyin. Reaksiyonu oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından 5x stop tamponu ekleyin.
MOV10 helicase aktivite tahliliçin, el yazması yönlere göre reaktifleri karıştırın ve 20 mikrolitrelik son reaksiyon hacmi için su ekleyin. Reaksiyonu 10 dakika, 30 dakika ve 60 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın ve reaksiyonu durdurmak için 5x stop arabelleği ekleyin. Daha sonra, % 20 yerli poliakrilamid jel hazırlamak ve her bir kuyu içine her örnek 20 ila 25 mikrolitre yükleyin.
Bromofenol mavi marker jel alt çeyreğine göç etti kadar bir buz banyosu üzerinde 100 volt jel çalıştırın. Akrilamid zararlı ve zehirlidir. Uygun kişisel koruyucu ekipman ile ele almak önemlidir.
Jel plakaları sökmek ve yükleme kuyuları ve kullanılmayan şeritler kaldırarak jel kırpın. Jeli 0,5x TBE arabelleği ne yerleştirin. Filtre kağıdını ve naylon membranı jel boyutuna kesin, kağıdı ve zarı önceden ıslayın ve transfer için desteyi birleştirin.
90 miliamperes bir yarı kuru elektroforetik cihaz 20 dakika boyunca jel den membran örnekleri aktarın. Daha sonra, 45 ila 60 saniye boyunca 120 milijoules santimetre kare membran ışınlayarak örnekleri çapraz bağlayın. Kemilüminesans tespiti için, membrana tampon engelleme 20 mililitre ekleyerek ve hafifçe sallayarak 15 ila 30 dakika kuluçka ile başlayın.
Engelleme arabelleği dikkatle kaldırın ve eşlekap/engelleme arabelleği ile değiştirin. Membranı tekrar 15 dakika kuluçkaya yatırın. Yıkama başına beş dakika sallayarak membranı dört kez yıkayın.
Sonra, membran aparatına 30 mililitre substrat denge tamponu ekleyin ve 20-25 rpm sallayarak beş dakika kuluçka. Membranın tüm yüzeyini substrat çalışma çözeltisi ile kaplayın ve beş dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, bir kemilüminesans görüntüleme sisteminde membranı 1-3 saniye tarar.
MEIOB proteinlerinin Arınması A, C ve E Coomassie mavi boyama ve batı leke analizi ile doğrulanabilir. Kırmızı oklar saflaştırılmış MEIOB proteinlerinin pozisyonlarını gösterir. MEIOB ve tek iplikli DNA etkileşimleri EMSA kullanılarak görselleştirilebilir.
Konsantrasyona bağlı bağlanma ve dekolte gözlenir. Beklendiği gibi, mutant MEIOB-E ve MEIOB-C yok ise sadece vahşi tip MEIOB-A DNA ile etkileşime. MEIOB ve tek iplikçikli RNA etkileşimleri de görülebilir.
Yabani tip MEIOB, tek iplikli RNA'da konsantrasyona bağlı bağlanma ve ekonükleaz aktivitesi gösterir. Ancak, nicel karşılaştırma MEIOB RNA daha yüksek verimlilik ile DNA bağlar gösterir. MOV10 saflaştırma Coomassie mavi boyama ile doğrulandı, ve proteinin helicase aktivitesi beş asal çıkıntı ile bir RNA dubleks üzerinde ölçüldü.
Reaksiyon süresi arttıkça, MOV10 çift iplikli RNA'yı kademeli olarak sarar. Teşp maliyetini azaltmak için, kemilüminesans tespiti ya algılama kiti reaktiflerinin iki kat seyreltilmesi yle ya da kendi kendine yapılmış reaktiflerle yapılabilir. Burada açıklanan protokol, emsa gibi in vitro biyokimyasal denemeler ve biyotinin yaygın olarak kullanılmadığı enzimatik reaksiyonlar için biotin etiketli nükleik asitleri başarıyla kullanmıştır.
