Il crescente interesse per lo studio di strutture grandi e multicellulari ha portato allo sviluppo di questa tecnica di compensazione ottica che consente una visualizzazione tridimensionale e la quantificazione di grandi strutture all'interno di organi trasparenti. Questo protocollo fornisce uno strumento semplice, economico, facile da configurare e completo per indagare i tessuti in tre dimensioni. La natura multistrato di una malattia non può sempre essere simulata dalle tecniche bidimensionali tradizionali.
L'analisi tridimensionale dei tessuti può aiutare a diagnosticare e monitorare meglio le malattie. Questo metodo non è limitato al tessuto renale e può essere applicato a qualsiasi tessuto normale e danneggiato. Questo semplice protocollo è facile da seguire per qualsiasi scienziato con una certa esperienza nella gestione degli animali.
È importante testare diversi anticorpi in caso di scarsa etichettatura degli anticorpi e condurre solo controlli anticorpali secondari. Inizia preparando l'eparina contenente PBS e paraformaldeide al 3,0% in 1X PBS secondo le indicazioni manoscritte e trasferendo le soluzioni in siringhe di plastica separate da 50 ml. La paraformaldeide è tossica e deve essere preparata nella cappa dei fumi.
Raccogliere e profuso il rene secondo le indicazioni del manoscritto. Quindi, rimuovere la capsula e tagliare il rene a fette coronali spesse un mm. Immergere le fette renali con la soluzione di paraformaldeide preparata in un tubo conico da 15 ml.
Dopo la fissazione, lavare la fetta di rene due volte con 1X tampone di lavaggio per un'ora su un rocker orizzontale e quindi procedere con il recupero dell'antigene. Riscaldare 300 mL di soluzione di smascheramento antigene 1X in un becher da 500 mL. Quindi, racchiudere una fetta di rene in una cassetta incorporante permeabile al tampone riscaldato e mescolarla per un'ora a 92-98 gradi Celsius.
È importante mantenere stabile la temperatura tra 92 e 98 gradi Celsius per questo passaggio di recupero dell'antigene. Quindi trasferire la fetta in 10 mL di tampone di lavaggio 1X con 0,1%Triton X-100 e dondola durante la notte. Il giorno successivo, lavare la fetta due volte con 10 mL di tampone di lavaggio 1X fresco per un'ora.
Diluire l'anticorpo primario in 500 microlitri di diluente anticorpale normale. Scuotere delicatamente la fetta renale in anticorpo primario diluito per quattro giorni a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare la fetta di rene in 10 mL di tampone di lavaggio 1X durante la notte a temperatura ambiente, cambiando il tampone una volta dopo otto ore.
Diluire gli anticorpi secondari in 500 microlitri di diluente anticorpale normale e incubare con la fetta renale per quattro giorni a 37 gradi Celsius. Si prega di notare che da questo passo avanti, la fetta di rene dovrebbe essere protetta dalla luce. Dopo l'incubazione con anticorpi secondari, lavare la fetta di rene in 10 mL di tampone di lavaggio 1X durante la notte a temperatura ambiente.
Per disidratare la fetta di rene, trasferirla a cinque mL di etanolo di alta qualità al 100% e scuoterla per due ore a temperatura ambiente, rinfrescando l'etanolo dopo un'ora. Immergere delicatamente la fetta di rene in due mL di cinnamato etilico e roccia durante la notte. Quando sei pronto per l'immagine del tessuto, aggiungi da 600 a 1000 microlitri di cinnamato etilico in un piatto con fondo di vetro e trasferisci la fetta di rene nel piatto.
Posizionare una copertura rotonda sulla fetta di rene e sigillare il piatto con pellicola di paraffina. Posizionare il piatto sulla piattaforma di imaging al microscopio e immaginare il tessuto in base alle indicazioni del manoscritto. Questo protocollo è stato utilizzato per eseguire con successo analisi 3D sul tessuto renale e valutare le funzioni e le interazioni cellulari.
Il metodo può causare tempra fluorescente reporter, ma altre forti proteine fluorescenti possono resistere alla tempra del segnale. La profusione aortica addominale può migliorare la diffusione degli anticorpi. In alcuni casi, una scarsa penetrazione degli anticorpi si traduce in un segnale superficiale.
Questo può essere corretto con concentrazioni più elevate o rifornimento di anticorpi. La consegna intravascolare deve essere presa in considerazione se l'antigene di interesse è espresso nella vascolarizzazione renale. Tuttavia, gli anticorpi che prendono di mira le proteine nella membrana apicale delle cellule epiteliali tubuliche non attraversano la barriera di filtrazione glomerulare e causano segnali non specifici.
Il tessuto può essere etichettato con gli anticorpi per rilevare una specifica popolazione cellulare o per visualizzare interi segmenti di tubuli. Inoltre, la colocalizzazione delle proteine in 3D può essere ottenuta combinando anticorpi multipli. È importante ricordare che l'etichettatura degli anticorpi può essere migliorata con una buona profusione renale, l'uso di fase di recupero dell'antigene e un'alta concentrazione di anticorpi.
Alcune proteine reporter forti possono resistere alla tempra del segnale fluorescente seguendo questo protocollo. Per testare questo, salta i passaggi di recupero dell'antigene e di etichettatura degli anticorpi. Questa tecnica rispetta la natura tridimensionale delle strutture e apre molte nuove aree di ricerca.
Elimina le ipotesi e le interferenze richieste associate all'analisi bidimensionale tradizionale.
