تلطيخ ثلاثي الأبعاد للكلى بالكامل مع CUBIC

يسمح هذا البروتوكول بتصور الهياكل ثلاثية الأبعاد في الكلى الكاملة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى اكتشافات مبتكرة في أبحاث الكلى من خلال توفير منظور عياني. يعد تلطيخ الأعضاء بالكامل أمرا صعبا بسبب صعوبة اختراق الأجسام المضادة. أظهر هذا البروتوكول تلطيخ الكلى بالكامل بالأجسام المضادة.

للبدء ، قم بإجراء تثبيت الغمر مباشرة بعد تثبيت التروية وأخذ عينات الكلى ، عن طريق غمر الكلى في 4٪ بارافورمالدهيد عند أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة. أعط ثلاث غسلات باستخدام PBS لمدة ساعتين لكل منهما. قم بإجراء عملية إزالة اللون وإزالة الدهون عن طريق غمر الكلى الثابتة في سبعة ملليمترات من 50٪ CUBIC-L في أنبوب دائري القاع سعة 14 ملليلتر ، مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة.

بعد ست ساعات ، اغمر الكلى في سبعة ملليلتر من CUBIC-L في أنبوب دائري القاع 14 ملم ، مع اهتزاز لطيف عند 37 درجة مئوية لمدة خمسة أيام. قم بتحديث CUBIC-L كل يوم. بمجرد اكتمال إزالة اللون وإزالة الدهون ، استخدم ملعقة توزيع للتعامل مع العينات واغسل الكلى ثلاث مرات باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

Immunostain الكلى delipidated في الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول عازلة تلطيخ ، مع اهتزاز لطيف في شاكر حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة سبعة أيام. بعد ذلك ، اغسل الكلى باستخدام 0.5٪ Triton X-100 في PBS ، المعروف أيضا باسم PBST ، في درجة حرارة الغرفة ليوم واحد. بالنسبة لتلطيخ الأجسام المضادة الثانوية ، عالج الكلى بأجسام مضادة ثانوية في المخزن المؤقت للتلطيخ ، في الظلام ، مع اهتزاز لطيف عند 37 درجة مئوية لمدة سبعة أيام.

إصلاح تلطيخ مع غسل PBST في درجة حرارة الغرفة ليوم واحد. بعد التثبيت ، اغمر الكلى في 1٪ فورمالديهايد في PB لمدة ثلاث ساعات ، واغسلها باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة ست ساعات. قم بإجراء مطابقة معامل الانكسار عن طريق غمر الكلى في سبعة ملليلتر من 50٪ CUBIC-R + في أنبوب دائري القاع سعة 14 ملليلتر مع الاهتزاز لمدة يوم واحد ، يليه العلاج بسبعة ملليلتر من CUBIC-R + مع الاهتزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.

بمساعدة طريقة تلطيخ المناعة ، تم تصور الأعصاب والشرايين المتعاطفة في الكلى بأكملها في تصوير الكلى 3D. علاوة على ذلك ، تم تصوير الأعصاب الكلوية المتعاطفة غير الطبيعية بعد إصابة نقص التروية. سهل هذا البروتوكول أيضا تصور الأعصاب الودية في الطحال بأكمله.

يتم عرض عملية القياس الكمي للبيانات للتلطيخ المناعي ثلاثي الأبعاد هنا. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصور قنوات التجميع ، والجزء S1 من الأنابيب القريبة ، والكبيبات بنجاح في كلية كاملة. كما تم تصور تضخم الكبيبات المكبوت ، الناتج عن إعطاء الدواء في المراحل المبكرة من مرض الكلى السكري ، في التصوير 3D.

يمكن لهذا البروتوكول تسمية جزيء معين داخل كلية بأكملها. وبالتالي ، يمكن للباحثين تحليل تغيير البنية في الأوعية الدموية أو العثور على أحداث نادرة في أنسجة الكلى.