هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح لتوضيح الدور الذي تلعبه القوى الخلوية في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية ، مثل التئام الجروح وانبثاث السرطان ، على سبيل المثال. والميزة الرئيسية لهذه التقنية القائمة على الميكانيكا هي قدرتها على تعطيل تقاطعات الخلايا الخلوية وقياس تأثيرها على القوى الميكانيكية المولدة بالخلايا، وبشكل رئيسي الجرات والضغوطات بين الخلايا. بروتوكول لدينا ينطبق على مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية، مثل الانبثاث السرطان، ثيريوسكليروس، وارتفاع ضغط الدم، على سبيل المثال.
ويمكن دمج أساليبنا لإجراء كل من التحليل الكيميائي الحيوي والميكانيكية الحيوية مع نماذج الأعضاء على رقاقة، وناميكيات الأنسجة المهندسة حيويا، في نظم تسليم المخدرات في المختبر، ونظم الأنسجة المشتركة في الثقافة. بروتوكولنا واضح إلى حد ما لأداء. ومع ذلك، فإننا ننصح أولئك الذين يقومون بهذا البروتوكول لأول مرة أن يتحلوا بالصبر وألا يتسرعوا في خطوات هذا البروتوكول.
يحتوي البروتوكول على خطوات فريدة قد لا تكون واضحة للمستخدمين لأول مرة. لذلك، نشجع المستخدمين على اتباع إجراءاتنا المكتوبة خطوة بخطوة واستخدام العروض التوضيحية المرئية كتوجّهات. للبدء ، قم بإعداد محلول Blind-silane عن طريق خلط 200 ملليلتر من الماء النقي للغاية مع 80 ميكرولتر من حمض الخليك و 50 ميكرولترات من السيلان ميتهاكريلات.
يُحرّك محلول Bind-silane على لوحة مُحرّكة لمدة ساعة واحدة على الأقل. علاج مركز جيدا من طبق بيتري مع حل ربط سيلاني لمدة 45 دقيقة. إزالة حل ربط سيلاني وشطف طبق بيتري مع المياه النقية جدا مرتين إلى ثلاث مرات.
جفف سطح طبق بيتري واخزن في درجة حرارة الغرفة للاستخدام في المستقبل. لإعداد محلول الهيدروجيل، اخلط 12.49 ملليلتر من المياه النقية إلى 2.062 ملليلتر من 40٪ من الأكريلاميد و 375 ميكرولترات من 2٪ بياستريلاميد في أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر. إضافة 80 ميكرولترات من الخرز الفلورسنت إلى حل هيدروجيل.
يهز بلطف أنبوب لخلط الخرز مع حل هلام. إبقاء الغطاء فضفاضة على أنبوب الطرد المركزي ووضعها في غرفة فراغ. إزالة الغاز حل هلام لمدة 45 دقيقة على الأقل في غرفة فراغ.
لتبلمر الهيدرجيل، أولا إضافة 75 ميكرولترات من 10٪ persulphate الأمونيوم ومن ثم إضافة ثمانية ميكرولترات من TEMED إلى محلول هيدروجيل. ضع 24 ميكرولترات من محلول الهيدروجيل في وسط طبق بيتري. اضغط على الهيدرجيل مع زلة غطاء 18 ملليمتر لتسطيح الهيدروجيل وجعل ارتفاع ما يقرب من 100 ميكرومتر.
انتظر على الأقل 30 إلى 40 دقيقة للبليمرة هلام. غمر الهيدروجيل البلمر في الماء النقي جدا لمنع الجفاف هلام. غطي طبق بيتري برقائق الألومنيوم لمنع الفوتبلاش من الخرز الفلورسنت وتخزينه عند أربع درجات مئوية.
أولاً، اخلطي قاعدة سيليكون PDMS مع عامل معالجة السيليكون بنسبة 20 إلى واحد في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. عكس أنبوب رأسا على عقب وتهز بقوة عدة مرات لضمان خلط السليم من حل PDMS. إزالة الفقاعات في حل PDMS عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 190 مرة G.Pour 5 إلى 6 ملليلتر من حل PDMS في وسط طبق بيتري 100 ملليمتر وتهيج الطبق حتى الحل PDMS يغطي كامل سطح طبق بيتري.
علاج حل PDMS بين عشية وضحاها في 50 إلى 60 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بإزالة استنسل PDMS دائري قطره 16 ملليمترًا مع فتحة ثقب. استخدام 1.25 ملليمتر قطر خزعة لكمة لخلق ثقوب صغيرة في استنسل PDMS.
تعقيم الإستنسل PDMS عن طريق غمرها في 70٪ الإيثانول لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق، التعرق قبالة الإيثانول الزائد ومن ثم وضع تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق. التعرق أي فائض السائل وإزالة زلة الغطاء من الهيدروجيل. ضع استنسل PDMS على سطح الهيدروجيل واستخدم الملاقط لتطبيق ضغط خفيف على استنسل PDMS لضمان ختم محكم الماء بين استنسل PDMS وسطح الهيدروجيل.
تغطية سطح الهيدرجيل مع Sulfo-SAMPA المذابة في 0.1 مولا HEPES حل العازلة بتركيز من واحد إلى 1،000 ووضع الهيدروجيل تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية مع قوة 36 واط لمدة ثماني دقائق. التعرق الزائدة Sulfo-SAMPA وHPES الحل وشطف هيدروجيل مرتين مع 0.1 0.1 الزأول HEPES تليها اثنين إضافية يشطف مع المياه النقية جدا. التعرق الزائدة المياه النقية جدا واستخدام ماصة 200 ميكرولتر لمعطف الهيدروجيل مع 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر من الكولاجين-1.
تغطية الطبق لحماية الخرز الفلورسنت من photobleaching وتخزين هيدروجيل في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. الآن، إضافة ثلاثة ملليلترات من 1X تريبسين في القارورة ووضعها في الحاضنة في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق لفصل الخلايا من قارورة زراعة الأنسجة. بعد التبسيني، إضافة ثلاثة ملليلتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية في قارورة، دوامة لخلط، ونقل الخليط إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر.
الطرد المركزي حل الخلية لمدة ثلاث دقائق في 1، 710 مرات G.Aspirate االكبيرة وإعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام إلى تركيز 50 مرة 10 إلى الخلايا الأربع لكل ملليلتر. أخرج طبق الهيدروجيل من الثلاجة. إزالة الكولاجين-1 من الهيدرجيل وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
إضافة 75 مرات 10 إلى الخلايا الثالثة إلى أعلى استنسل PDMS والسماح للخلايا لإرفاق إلى سطح الهيدروجيل لمدة ساعة واحدة على الأقل في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإزالة استنسل PDMS وغمر استنسل PDMS في 10X Trypsin لمدة 10 إلى 15 ثانية لإزالة أي خلايا مرفقة. إضافة ما لا يقل عن ملليلتر من وسائل الإعلام إلى طبق بيتري وتعقيم الاستنسل عن طريق الرش مع 70٪ الإيثانول، ومن ثم وضع تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق.
ضع طبق بيتري في الحاضنة لمدة 36 ساعة على الأقل ، أو حتى يتم ملاحظة طبقة أحادية اة. تم مقارنة صور الطور التباين من 30 دقيقة قبل العلاج chalcone وساعتين بعد العلاج الشالكون. ولوحظ أن حالات الإزاحة التي تسببها الخلية في الخرز تقل في كل من الزلكون المنخفض الجرعة والحالات التشالكونية ذات الجرعة العالية عند مقارنتها بالسيطرة على الطبقات الأحادية HUVEC.
قبل العلاج chalcone، كان الجر RMS حوالي 51 باسكال لجميع الظروف. بعد العلاج chalcone, كان هناك زيادة صغيرة في الجر RMS إلى 59 باسكال في جرعة منخفضة يعامل الشالكون monolayers وانخفاض ما يقرب من الضعفين في الجر RMS إلى 18 باسكال في جرعة عالية chalcone تعامل monolayers بالمقارنة مع السيطرة. زاد علاج الشالكون متوسط حجم الإجهاد العادي بين الخلايا مع جرعة منخفضة ، ولكنه انخفض بشكل كبير متوسط حجم الإجهاد العادي بين الخلايا مع جرعة عالية بالمقارنة مع التحكم.
كما انخفض علاج التشالكون أقصى الضغوط بين الخلايا في كل من تركيز التشالكون المنخفض والعالي بالمقارنة مع التحكم. تأثير علاج التشالكون مهم إحصائياً استناداً إلى كل من T-tests واختبار ANOVA واحد عامل. أثناء وضع استنسل PDMS على رأس الجل ، تأكد من أن الجل جاف بما يكفي لضمان ختم محكم الماء بين استنسل PDMS والجل.
ويمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول للتحقيق في مساهمة البيوميكانيكية لمجموعة متنوعة من تقاطعات الخلايا الخلوية، والبروتينات الهيكلية الهيكلية، وجزيئات التصاق مصفوفة الخلية، أو الجزيئات خارج الخلية مع التصوير الحي. مع هذا البروتوكول في المختبر، يمكن للباحثين الآن التحقيق بنجاح مجموعة من الميكانيكا الحيوية، فضلا عن الخصائص الكيميائية الحيوية أثناء إصلاح الأنسجة، والتئام الجروح، أو الانبثاث السرطانية دون نموذج حيواني. ونحن ننصح المشاهدين لدينا أن نكون حذرين جدا أثناء التعامل مع الشالكون وDMSO كما يقال استنشاق هذه الأدوية أن تكون ضارة.
