Bu protokol, örneğin yara iyileşmesi ve kanser metastazları gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçte hücresel güçlerin oynadığı rolün açıklanmasına olanak sağladığı ndan önemlidir. Bu mekanik tabanlı tekniğin en büyük avantajı aynı anda hücre-hücre kavşakları bozmak ve hücre tarafından oluşturulan mekanik kuvvetler üzerindeki etkisini ölçmek için yeteneğidir, özellikle çekiş ve hücreler arası stres. Protokolümüz, örneğin kanser metastazları, ateroskrozlar ve hipertansiyon gibi çok çeşitli patofizyolojik süreçler için geçerlidir.
Yöntemlerimiz, hem biyokimyasal hem de biyomekanik analizleri organ-çip modelleri, biyo-mühendislik doku yapıları, in vitro ilaç dağıtım sistemleri ve doku ortak kültür sistemleri ile entegre edilebilir. Protokolümüzü gerçekleştirmek oldukça basittir. Ancak bu protokolü ilk defa yapanlara sabır göstermelerini ve bu protokolün adımlarını aceleye getirmemelerini öneriyoruz.
Protokolümüz, ilk kez kullananlar için açık olmayan benzersiz adımlara sahiptir. Bu nedenle, kullanıcıları yazılı adım adım prosedürlerimizi takip etmeye ve görsel gösterileri rehberlik olarak kullanmaya teşvik ediyoruz. Başlamak için, 200 mililitre ultra saf suyu 80 mikrolitre asetik asit ve 50 mikrolitre silane metakrilat ile karıştırarak Blind-silane çözeltisini hazırlayın.
Bind-silane çözeltisini en az bir saat karıştırın. Bind-silane solüsyonu ile petri kabının merkezini 45 dakika iyi şımartın. Bind-silane çözeltisini çıkarın ve Petri kabını ultra saf suyla 2-3 kez durulayın.
Petri çanak yüzeyini kurulayın ve ileride kullanmak üzere oda sıcaklığında saklayın. Hidrojel çözeltisini hazırlamak için, 12,49 mililitre ultra saf suyu 2,062 mililitre %40 akrilamid ve 375 mikrolitre %2 bisacrylamid 15 mililitrelik bir santrifüj tüpte karıştırın. Hidrojel çözeltisine 80 mikrolitre floresan boncuk ekleyin.
Yavaşça jel çözeltisi ile boncuk karıştırmak için tüp sallayın. Kapağı santrifüj tüpünde gevşek tutun ve bir vakum odasına yerleştirin. Jel çözeltisini vakum odasında en az 45 dakika gazlayın.
Hidrojeli polimerize etmek için önce %10 amonyum persülfat75 mikrolitre ekleyin ve hidrojel çözeltisine sekiz mikrolitre TEMED ekleyin. Petri kabının ortasına 24 mikrolitre hidrojel çözeltisi yerleştirin. Hidrojeli düzleştirmek ve yaklaşık 100 mikrometre yükseklikte yapmak için 18 milimetrelik kapak lı hidrojelüzerine basın.
Jel polimerizasyonu için en az 30-40 dakika bekleyin. Jel dehidratasyon önlemek için ultra saf suya polimerize hidrojel batırın. Floresan boncukların fotobeyazmasını önlemek için Petri kabını alüminyum folyo ile kaplayın ve dört santigrat derecede saklayın.
İlk olarak, 50 mililitrelik bir santrifüj tüp 20'ye bir oranında silikon kür maddesi ile PDMS silikon tabanı karıştırın. PDMS çözeltisinin doğru şekilde karıştırılmasını sağlamak için tüpü ters çevirin ve birden fazla kez sallayın. 190 kez G.Pour 100 milimetrelik Petri kabının ortasında PDMS çözeltisi beş ila altı mililitre dökün bir dakika için santrifüj ederek PDMS çözümündeki kabarcıkları çıkarın ve PDMS çözeltisi tüm Petri çanak yüzeyini kaplayana kadar kabı boşaltın.
PDMS çözeltisini bir gecede 50 ila 60 santigrat derecede tedavi edin. Ardından, 16 milimetre çapındaki pdms şablonunu delik li zımba ile çıkarın. PDMS şablonunda küçük delikler oluşturmak için 1,25 milimetre çapında biyopsi yumruğu kullanın.
PDMS şablonlarını 2-3 dakika boyunca %70 etanol le batırarak, aşırı etanolün aspire edilerek ve uv ışığının altına beş dakika yerleştirerek sterilize edin. Herhangi bir fazla sıvı aspire ve hidrojel kapak kayma kaldırın. PDMS şablonunu hidrojel yüzeyine yerleştirin ve PDMS şablonu ile hidrojel yüzeyi arasında su geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için PDMS şablonuna Hafif basınç uygulamak için cımbız kullanın.
Hidrojelyüzeyini Sulfo-SAMPA ile kaplayın 0,1 molar HEPES tampon çözeltisi içinde 1'e 1,000 konsantrasyonda çözünmüş ve hidrojeli 8 dakika boyunca 36 watt gücünde bir UV lambasının altına yerleştirin. Aşırı Sulfo-SAMPA ve HEPES çözeltisini aspire edin ve hidrojeli 0,1 molar HEPES ile iki kez durulayın ve ardından ultra saf suile iki durulama daha. Aşırı ultra saf su aspire ve Kollajen-1 mililitre başına 0,1 miligram ile hidrojel kaplamak için 200 mikrolitrelik pipet kullanın.
Floresan boncukları fotobeyazrlamadan korumak için yemeğin üzerini kapatın ve hidrojeli bir gecede dört santigrat derecede saklayın. Şimdi, şişeye üç mililitre 1X Tripsin ekleyin ve hücreleri doku kültürü şişesinden ayırmak için 37 santigrat derecede 37 santigrat derecede kuvöze yerleştirin. Tripsinizasyondan sonra, şişeye üç mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin, karıştırmak için girdap ve karışımı 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.
Hücre çözeltisini 1 dakika için santrifüj edin, 710 kez G.Aspire süpernatant ve mililitre başına dört hücre ye 50 kez 10 konsantrasyoniçin medya hücreleri yeniden askıya. Hidrojel kabını buzdolabından çıkar. Kollajen-1'i hidrojelden çıkarın ve PBS ile bir kez durula.
PDMS şablonunun üstüne üçüncü hücrelere 75 kat 10 ekleyin ve hücrelerin 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le kuvözde en az bir saat hidrojel yüzeyine bağlanmasını bekleyin. PDMS şablonunu çıkarın ve bağlı hücreleri kaldırmak için 10X Trypsin'de 10x Trypsin'e 10 ila 15 saniye daldırın. Petri kabına en az iki mililitre ortam ekleyin ve şablonu %70 etanol püskürterek ve uv ışığının altına beş dakika süreyle yerleştirerek sterilize edin.
Petri kabını en az 36 saat veya enfluent bir monolayer gözlemlenene kadar kuvözde yerleştirin. Chalcone tedavisinden 30 dakika önce ve kalkon tedavisinden iki saat sonra faz kontrast görüntüleri karşılaştırıldı. Hücre kaynaklı boncuk yer değiştirmelerinin huvec monolayers kontrolüile karşılaştırıldığında hem düşük doz kalkon hem de yüksek doz kalkson koşullarında azaldığı gözlenmiştir.
Chalcone tedavisinden önce, RMS çekişleri tüm koşullar için 51 Pascal civarındaydı. Chalcone tedavisinden sonra, düşük doz alkklon tedavi monokatmanlarında 59 Pascal'a rms çekişlerinde küçük bir artış ve kontrole göre yüksek doz alkklon tedavi edilen monokatmanlarda 18 Pascal'a kadar RMS çekişlerinde neredeyse iki kat azalma görüldü. Chalcone tedavisi düşük doz ile ortalama normal hücreler arası stres büyüklüğü arttı, ama önemli ölçüde kontrol ile karşılaştırıldığında yüksek doz ile ortalama normal hücreler arası stres büyüklüğü azaldı.
Chalcone tedavisi de kontrol ile karşılaştırıldığında düşük ve yüksek chalcone konsantrasyonu hem de maksimum katıksız hücreler arası gerilmeleri azalttı. Kalkon tedavisinin etkisi hem T-testlerine hem de tek faktörlü ANOVA testine dayalı olarak istatistiksel olarak anlamlıdır. Jelüstüne PDMS şablon uyup, jelin PDMS şablonu ile jel arasında su geçirmez bir conta oluşturacak kadar kuru olduğundan emin olun.
Bu protokol aynı zamanda hücre-hücre kavşakları, sitoskeletal proteinler, hücre matris adezyon molekülleri veya canlı görüntüleme ile hücre dışı moleküllerin biyomekanik katkısını araştırmak için de uygulanabilir. Bu in vitro protokolü ile, araştırmacılar artık başarıyla biyomekanik bir dizi araştırabilirsiniz, yanı sıra doku onarımı sırasında biyokimyasal özellikleri, yara iyileşmesi, veya hayvan modeli olmadan kanser metastazları. İzleyicilerimize, bu ilaçların solunması zararlı olduğu bildirildiğinden, chalcone ve DMSO'yu ele alırken çok dikkatli olmalarını tavsiye ederiz.
