Este protocolo é significativo, pois permite a elucidação do papel que as forças celulares desempenham em muitos processos fisiológicos e patológicos, como a cicatrização de feridas e metástases cancerígenas, por exemplo. A principal vantagem desta técnica baseada em mecânica é sua capacidade de interromper simultaneamente as junções celular-célula e medir seu impacto sobre as forças mecânicas geradas por células, principalmente traçãos e estressores intercelulares. Nosso protocolo é aplicável a uma ampla gama de processos fisioterapêutos, como metástases cancerígenas, atheroscleroses e hipertensão, por exemplo.
Nossos métodos podem ser integrados para realizar análises bioquímicas e biomecânicas com modelos de órgãos em chip, construções de tecidos bio-projetados, sistemas de entrega de medicamentos in vitro e sistemas de cocultura tecidual. Nosso protocolo é bastante simples de executar. No entanto, aconselhamos aqueles que fazem este protocolo pela primeira vez a ter paciência e não correr pelas etapas deste protocolo.
Nosso protocolo tem etapas únicas que podem não ser claras para os usuários iniciantes. Por isso, encorajamos os usuários a seguir nossos procedimentos passo a passo escritos e usar demonstrações visuais como orientação. Para começar, prepare a solução de silano cego misturando 200 mililitros de água ultra pura com 80 microliters de ácido acético e 50 microliters de metacrilato de silano.
Mexa a solução bind-silane em uma placa de mexida por pelo menos uma hora. Trate o poço central de uma placa de Petri com a solução Bind-silane por 45 minutos. Remova a solução Bind-silane e enxágue a placa de Petri com água ultra pura duas a três vezes.
Seque a superfície da placa de Petri e armazene à temperatura ambiente para uso futuro. Para preparar a solução de hidrogel, misture 12,49 mililitros de água ultra pura a 2.062 mililitros de 40% de acrilamida e 375 microlitadores de 2%bisacrilamida em um tubo centrífuga de 15 mililitros. Adicione 80 microliters de contas fluorescentes à solução de hidrogel.
Agite suavemente o tubo para misturar as contas com a solução de gel. Mantenha a tampa solta no tubo de centrífuga e coloque-a em uma câmara de vácuo. Desaum o gel solução por pelo menos 45 minutos na câmara de vácuo.
Para polimerizar o hidrogel, primeiro adicione 75 microlitadores de persulfato de 10% de amônio e, em seguida, adicione oito microliters de TEMED à solução de hidrogel. Coloque 24 microliters da solução de hidrogel no centro da placa de Petri. Pressione o hidrogel com uma tampa de 18 milímetros para achatar o hidrogel e fazer uma altura de aproximadamente 100 micrômetros.
Aguarde pelo menos 30 a 40 minutos para polimerização de gel. Submergir o hidrogel polimerizado em água ultra pura para evitar a desidratação do gel. Cubra a placa de Petri com papel alumínio para evitar o fotobleaching de contas fluorescentes e armazene a quatro graus Celsius.
Primeiro, misture a base de silicone PDMS com o agente de cura de silicone em uma proporção de 20 para um em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Inverta o tubo de cabeça para baixo e agite vigorosamente várias vezes para garantir a adequada mistura da solução PDMS. Remova as bolhas na solução PDMS centrifugando por um minuto a 190 vezes G.Despeje de cinco a seis mililitros da solução PDMS no centro de uma placa de Petri de 100 milímetros e agitar a placa até que a solução PDMS cubra toda a superfície da placa de Petri.
Cure a solução PDMS durante a noite a 50 a 60 graus Celsius. Em seguida, remova um estêncil PDMS de diâmetro circular de 16 milímetros com um perfurador de furos. Use um perfurado de biópsia de 1,25 milímetros de diâmetro para criar pequenos orifícios no estêncil PDMS.
Esterilize os estêncil PDMS submergindo-os em 70% de etanol por dois a três minutos, aspirando o excesso de etanol e, em seguida, colocando sob uma luz UV por cinco minutos. Aspire qualquer excesso de líquido e remova o deslizamento da tampa do hidrogel. Coloque o estêncil PDMS na superfície do hidrogel e use pinças para aplicar pressão leve ao estêncil PDMS para garantir uma vedação à base de água entre o estêncil PDMS e a superfície do hidrogel.
Cubra a superfície do hidrogel com Sulfo-SAMPA dissolvido em solução tampão HEPES molar de 0,1 molar a uma concentração de 1 a 1.000 e coloque o hidrogel sob uma lâmpada UV com potência de 36 watts por oito minutos. Aspire o excesso de solução Sulfo-SAMPA e HEPES e enxágue o hidrogel duas vezes com HEPES molar 0,1 seguido de duas enxágues adicionais com água ultra pura. Aspire o excesso de água ultra pura e use uma pipeta de 200 microliter para revestir o hidrogel com 0,1 miligramas por mililitro de Colágeno-1.
Cubra o prato para proteger as contas fluorescentes de fotobleaching e armazene o hidrogel a quatro graus Celsius durante a noite. Agora, adicione três mililitros de 1X Trypsin no frasco e coloque-o na incubadora a 37 graus Celsius por três a cinco minutos para separar as células do frasco de cultura tecidual. Após a experimentação, adicione três mililitros de mídia de cultura celular no frasco, redemoinho para misturar e transfira a mistura em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Centrifugar a solução celular por três minutos a 1.710 vezes G.Aspire o supernasce e suspenda as células na mídia para uma concentração de 50 vezes 10 às quatro células por mililitro. Retire o prato de hidrogel da geladeira. Remova o Colágeno-1 do hidrogel e enxágue uma vez com PBS.
Adicione 75 vezes 10 às terceiras células ao topo do estêncil PDMS e permita que as células se conectem à superfície do hidrogel por pelo menos uma hora na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Remova o estêncil PDMS e submerse o estêncil PDMS em Trypsin 10X por 10 a 15 segundos para remover todas as células anexadas. Adicione pelo menos dois mililitros de mídia à placa de Petri e esterilize o estêncil pulverizando com 70% de etanol e, em seguida, colocando sob a luz UV por cinco minutos.
Coloque a placa de Petri na incubadora por pelo menos 36 horas, ou até que uma monocamada confluente seja observada. Imagens de contraste de fase de 30 minutos antes do tratamento de chalcone e duas horas após o tratamento de chalcone foram comparadas. Os deslocamentos de contas induzidos por células foram observados para diminuir tanto em condições de chalcone de baixa dose quanto em altas doses quando comparados às monocamadas huvec de controle.
Antes do tratamento de chalcone, as traçãos RMS eram em torno de 51 Pascals para todas as condições. Após o tratamento de chalcone, houve um pequeno aumento nas traçãos RMS para 59 Pascals em monocamadas tratadas com baixa dose e uma redução de quase duas vezes nas trações RMS para 18 Pascals em monocamadas tratadas com alta dose em comparação com o controle. O tratamento chalcone aumentou a magnitude média normal do estresse intercelular com baixa dose, mas diminuiu significativamente a magnitude média normal de estresse intercelular com alta dose quando comparado ao controle.
O tratamento de chalcone também diminuiu as tensões intercelulares máximas tanto na baixa quanto na alta concentração de chalcone quando comparado ao controle. O impacto do tratamento chalcone é estatisticamente significativo com base tanto nos testes T quanto no teste ANOVA de fator único. Ao colocar estêncil PDMS em cima do gel, certifique-se de que o gel está seco o suficiente para garantir uma vedação apertada entre o estêncil PDMS e o gel.
Este protocolo também pode ser aplicado para sondar a contribuição biomecânica de uma variedade de junções células células, proteínas citoesqueletal, moléculas de adesão da matriz celular ou moléculas extracelulares com imagens vivas. Com este protocolo in vitro, os pesquisadores agora podem investigar com sucesso uma série de propriedades biomecânicas, bem como propriedades bioquímicas durante a reparação de tecidos, cicatrização de feridas ou metástases de câncer sem modelo animal. Aconselhamos nossos espectadores a serem muito cuidadosos ao manusear chalcone e DMSO, pois a inalação dessas drogas é relatada como prejudicial.
