Este protocolo es significativo, ya que permite el esclarecido del papel que desempeñan las fuerzas celulares en muchos procesos fisiológicos y patológicos, como la cicatrización de heridas y las metástasis del cáncer, por ejemplo. La principal ventaja de esta técnica basada en la mecánica es su capacidad para interrumpir simultáneamente las uniones de células celulares y medir su impacto en las fuerzas mecánicas generadas por células, principalmente tracción y factores de estrés intercelulares. Nuestro protocolo es aplicable a una amplia gama de procesos fisiopatológicos, como metástasis de cáncer, aterosclerosas e hipertensión, por ejemplo.
Nuestros métodos se pueden integrar para realizar análisis bioquímicos y biomecánicos con modelos de órgano en chip, construcciones de tejidos bio-ingeniería, sistemas de administración de fármacos in vitro y sistemas de cultivo de tejidos. Nuestro protocolo es bastante sencillo de realizar. Sin embargo, aconsejamos a aquellos que hacen este protocolo por primera vez que tengan paciencia y no se apresuren a través de los pasos de este protocolo.
Nuestro protocolo tiene pasos únicos que pueden no ser claros para los usuarios por primera vez. Por lo tanto, animamos a los usuarios a seguir nuestros procedimientos paso a paso escritos y usar demostraciones visuales como guía. Para empezar, prepare la solución de cido-siano ciego mezclando 200 mililitros de agua ultra pura con 80 microlitros de ácido acético y 50 microlitros de metacrilato de silano.
Revuelva la solución de Bind-silane en una placa de agitación durante al menos una hora. Trate bien el centro de un plato de Petri con la solución Bind-silane durante 45 minutos. Retire la solución de Bind-silane y enjuague el plato Petri con agua ultra pura de dos a tres veces.
Seque la superficie de la placa Petri y guárdela a temperatura ambiente para su uso futuro. Para preparar la solución de hidrogel, mezcle 12,49 mililitros de agua ultra pura a 2,062 mililitros de 40% de acrilamida y 375 microlitros de 2% bisacrilamida en un tubo centrífugo de 15 mililitros. Añadir 80 microlitros de perlas fluorescentes a la solución de hidrogel.
Agitar suavemente el tubo para mezclar las perlas con la solución de gel. Mantenga la tapa suelta en el tubo de la centrífuga y colóquela en una cámara de vacío. Desa gasear la solución de gel durante al menos 45 minutos en la cámara de vacío.
Para polimerizar el hidrogel, primero agregue 75 microlitros de 10% persulfo de amonio y luego agregue ocho microlitros de TEMED a la solución de hidrogel. Coloque 24 microlitros de la solución de hidrogel en el centro de la placa Petri. Presione sobre el hidrogel con un resbalón de cubierta de 18 milímetros para aplanar el hidrogel y hacer una altura de aproximadamente 100 micrómetros.
Espere al menos de 30 a 40 minutos para la polimerización de gel. Sumerja el hidrogel polimerizado en agua ultra pura para evitar la deshidratación del gel. Cubra el plato Petri con papel de aluminio para evitar el fotoblanda de cuentas fluorescentes y guárdelo a cuatro grados centígrados.
En primer lugar, mezcle la base de silicona PDMS con el agente de curado de silicona en una proporción de 20 a uno en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Invierta el tubo boca abajo y agite vigorosamente varias veces para garantizar una mezcla adecuada de la solución PDMS. Retire las burbujas de la solución PDMS centrifugando durante un minuto a 190 veces G.Pour cinco a seis mililitros de la solución PDMS en el centro de un plato Petri de 100 milímetros y agitar el plato hasta que la solución PDMS cubra toda la superficie de la placa Petri.
Cure la solución PDMS durante la noche a 50 a 60 grados centígrados. A continuación, elimine una plantilla blanca PDMS de 16 milímetros de diámetro con un perforador. Utilice un punzón de biopsia de 1,25 milímetros de diámetro para crear pequeños agujeros en la plantilla PDMS.
Esterilice las plantillas de PDMS sumergiéndolas en un 70% de etanol durante dos o tres minutos, aspirando el exceso de etanol y luego colocándolas bajo una luz UV durante cinco minutos. Aspirar cualquier exceso de líquido y retirar el resbalón de la cubierta del hidrogel. Coloque la plantilla PDMS en la superficie del hidrogel y utilice pinzas para aplicar presión ligera a la plantilla PDMS para garantizar un sello hermético entre la plantilla PDMS y la superficie del hidrogel.
Cubra la superficie del hidrogel con Sulfo-SAMPA disuelto en una solución tampón HEPES molar 0.1 a una concentración de uno a 1.000 y coloque el hidrogel bajo una lámpara UV con una potencia de 36 vatios durante ocho minutos. Aspirar el exceso de solución de Sulfo-SAMPA y HEPES y enjuagar el hidrogel dos veces con 0,1 HEPES molar seguido de dos enjuagues adicionales con agua ultra pura. Aspirar el exceso de agua ultra pura y utilizar una pipeta de 200 microlitros para recubrir el hidrogel con 0,1 miligramos por mililitro de colágeno-1.
Cubra el plato para proteger las cuentas fluorescentes de la fotoblancada y almacene el hidrogel a cuatro grados centígrados durante la noche. Ahora, agregue tres mililitros de 1X de tripsina en el matraz y colóquelo en la incubadora a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos para separar las células del matraz de cultivo de tejido. Después de la tripinación, agregue tres mililitros de medios de cultivo celular en el matraz, gire para mezclar y transfiera la mezcla a un tubo centrífugo de 15 mililitros.
Centrifugar la solución celular durante tres minutos a 1, 710 veces G.Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en medios a una concentración de 50 veces 10 a las cuatro células por mililitro. Saca el plato de hidrogel del refrigerador. Retire el colágeno-1 del hidrogel y enjuague una vez con PBS.
Agregue 75 veces 10 a las terceras celdas a la parte superior de la plantilla PDMS y permita que las células se adhieran a la superficie del hidrogel durante al menos una hora en la incubadora a 37 grados Centígrados y 5% dióxido de carbono. Quite la galería de símbolos de PDMS y sumerja la galería de símbolos de PDMS en 10X Trypsin durante 10 a 15 segundos para eliminar las celdas conectadas. Agregue al menos dos mililitros de medios a la placa Petri y esterilizar la plantilla rociando con 70% de etanol, y luego colocándolo debajo de la luz UV durante cinco minutos.
Coloque el plato Petri en la incubadora durante al menos 36 horas, o hasta que se observe una monocapa confluente. Se compararon imágenes de contraste de fase de 30 minutos antes del tratamiento con chalcona y dos horas después del tratamiento con chalcona. Se observó que los desplazamientos de perlas inducidos por células disminuyen tanto en condiciones de chalcona en dosis bajas como en condiciones de chalcono en dosis altas en comparación con el control de las monocapas de HUVEC.
Antes del tratamiento con chalcona, las tracciones RMS eran alrededor de 51 Pascals para todas las condiciones. Después del tratamiento con chalcona, hubo un pequeño aumento en las tracciones RMS a 59 Pascals en monocapas tratadas con chalcona en dosis bajas y una disminución casi doble en las tracciones RMS a 18 Pascals en monocapas tratadas con chalcono en dosis altas en comparación con el control. El tratamiento con Chalcone aumentó la magnitud media del estrés intercelular normal con dosis bajas, pero disminuyó significativamente la magnitud media de tensión intercelular normal con dosis altas en comparación con el control.
El tratamiento con chalcona también disminuyó las tensiones intercelulares escuetas máximas a baja y alta concentración de chalcona en comparación con el control. El impacto del tratamiento con chalcona es estadísticamente significativo basado en pruebas T y pruebas ANOVA de factor único. Al colocar la plantilla PDMS encima del gel, asegúrese de que el gel esté lo suficientemente seco como para garantizar un sello hermético entre la plantilla PDMS y el gel.
Este protocolo también se puede aplicar para sondear la contribución biomecánica de una variedad de uniones de células celulares, proteínas citoesqueléticas, moléculas de adhesión de matriz celular o moléculas extracelulares con imágenes vivas. Con este protocolo in vitro, los investigadores ahora pueden investigar con éxito una serie de propiedades biomecánicas, así como bioquímicas durante la reparación de tejidos, la cicatrización de heridas o las metástasis de cáncer sin modelo animal. Aconsejamos a nuestros espectadores a ser muy cuidadosos durante el manejo de chalcone y DMSO como inhalación de estos medicamentos se divulga para ser perjudicial.
