Ce protocole est significatif car il permet d’élucider le rôle que jouent les forces cellulaires dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques, tels que la cicatrisation des plaies et les métastases cancéreuses, par exemple. Le principal avantage de cette technique mécanique est sa capacité à perturber simultanément les jonctions cellule-cellule et à mesurer son impact sur les forces mécaniques générées par les cellules, principalement les tractions et les facteurs de stress intercellulaires. Notre protocole s’applique à un large éventail de processus pathophysiologiques, tels que les métastases cancéreuses, les athéroscléroses et l’hypertension, par exemple.
Nos méthodes peuvent être intégrées pour effectuer à la fois des analyses biochimiques et biomécaniques avec des modèles d’organes sur puce, des constructions de tissus bio-machinés, des systèmes d’administration de médicaments in vitro et des systèmes de co-culture tissulaire. Notre protocole est assez simple à exécuter. Toutefois, nous conseillons à ceux qui font ce protocole pour la première fois d’avoir de la patience et de ne pas se précipiter à travers les étapes de ce protocole.
Notre protocole a des étapes uniques qui peuvent ne pas être claires pour les utilisateurs pour la première fois. Par conséquent, nous encourageons les utilisateurs à suivre nos procédures écrites étape par étape et à utiliser les démonstrations visuelles comme conseils. Pour commencer, préparez la solution Blind-silane en mélangeant 200 millilitres d’eau ultra pure avec 80 microlitres d’acide acétique et 50 microlitres de silane méthacrylate.
Remuer la solution Bind-silane sur une plaque à remuer pendant au moins une heure. Traitez bien le centre d’une boîte de Pétri avec la solution Bind-silane pendant 45 minutes. Retirer la solution Bind-silane et rincer la boîte de Pétri avec de l’eau ultra pure deux à trois fois.
Sécher la surface de la boîte de Pétri et la conserver à température ambiante pour une utilisation future. Pour préparer la solution hydrogel, mélanger 12,49 millilitres d’eau ultra pure à 2,062 millilitres d’acrylamide à 40 % et 375 microlitres de bisacrylamide de 2 % dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Ajouter 80 microlitres de perles fluorescentes à la solution hydrogel.
Agiter doucement le tube pour mélanger les perles avec la solution de gel. Gardez le bouchon en vrac sur le tube de centrifugeuse et placez-le dans une chambre à vide. Dé-gazer la solution de gel pendant au moins 45 minutes dans la chambre à vide.
Pour polymériser l’hydrogel, ajoutez d’abord 75 microlitres de 10% de persulphate d’ammonium, puis ajoutez huit microlitres de TEMED à la solution d’hydrogel. Placer 24 microlitres de la solution hydrogel au centre de la boîte de Pétri. Appuyez sur l’hydrogel avec un glissement de couvercle de 18 millimètres pour aplatir l’hydrogel et faire une hauteur d’environ 100 micromètres.
Attendez au moins 30 à 40 minutes pour la polymérisation du gel. Submergez l’hydrogel polymérisé dans de l’eau ultra pure pour prévenir la déshydratation du gel. Couvrir la boîte de Pétri de papier d’aluminium pour éviter la photobleaching des perles fluorescentes et les conserver à quatre degrés Celsius.
Tout d’abord, mélanger la base de silicone PDMS avec l’agent de séchage en silicone à un rapport de 20 pour un dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres. Inverser le tube à l’envers et secouer vigoureusement plusieurs fois pour assurer un bon mélange de la solution PDMS. Enlevez les bulles de la solution PDMS en centrifugant pendant une minute à 190 fois G.Versez cinq à six millilitres de la solution PDMS au centre d’une boîte de Pétri de 100 millimètres et agitez le plat jusqu’à ce que la solution PDMS couvre toute la surface de la boîte de Pétri.
Guérir la solution PDMS pendant la nuit à 50 à 60 degrés Celsius. Ensuite, retirez un pochoir PDMS circulaire de 16 millimètres de diamètre à l’intérieur d’un poinçonneur de trou. Utilisez un poinçon de biopsie de 1,25 millimètre de diamètre pour créer de petits trous dans le pochoir PDMS.
Stériliser les pochoirs PDMS en les submergeant à 70 % d’éthanol pendant deux à trois minutes, en aspirant à l’excès d’éthanol, puis en les plaçant sous une lumière UV pendant cinq minutes. Aspirer tout excès de liquide et retirer le bordereau de couverture de l’hydrogel. Placez le pochoir PDMS sur la surface de l’hydrogel et utilisez des pinces à épiler pour appliquer une pression lumineuse sur le pochoir PDMS afin d’assurer un joint étanche entre le pochoir PDMS et la surface hydrogel.
Couvrir la surface de l’hydrogel avec Sulfo-SAMPA dissous dans 0,1 molar HEPES solution tampon à une concentration de un à 1000 et placer l’hydrogel sous une lampe UV avec une puissance de 36 watts pendant huit minutes. Aspirez l’excès de solution Sulfo-SAMPA et HEPES et rincez l’hydrogel deux fois avec 0,1 molaire HEPES suivie de deux rinçages supplémentaires à l’eau ultra pure. Aspirez l’excès d’eau ultra pure et utilisez une pipette de 200 microlitres pour enrober l’hydrogel de 0,1 milligramme par millilitre de collagène-1.
Couvrez le plat pour protéger les perles fluorescentes contre le photobleaching et stockez l’hydrogel à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Maintenant, ajoutez trois millilitres de trypsine 1X dans le flacon et placez-le dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes pour détacher les cellules du flacon de culture tissulaire. Après la trypsinisation, ajouter trois millilitres de médias de culture cellulaire dans le flacon, tourbillonner pour mélanger, et transférer le mélange dans un tube centrifugeuse de 15 millilitres.
Centrifuger la solution cellulaire pendant trois minutes à 1710 fois G.Aspirer le supernatant et re-suspendre les cellules dans les médias à une concentration de 50 fois 10 à quatre cellules par millilitre. Sortez le plat d’hydrogel du réfrigérateur. Retirer le collagène-1 de l’hydrogel et rincer une fois avec PBS.
Ajouter 75 fois 10 aux troisièmes cellules au sommet du pochoir PDMS et permettre aux cellules de se fixer à la surface de l’hydrogel pendant au moins une heure dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Retirer le pochoir PDMS et submerger le pochoir PDMS en trypsine 10X pendant 10 à 15 secondes pour enlever les cellules attachées. Ajouter au moins deux millilitres de médias à la boîte de Pétri et stériliser le pochoir en pulvérisant avec 70% d’éthanol, puis en plaçant sous la lumière UV pendant cinq minutes.
Placer la boîte de Pétri dans l’incubateur pendant au moins 36 heures, ou jusqu’à ce qu’un monocouche confluent soit observé. Des images de contraste de phase de 30 minutes avant traitement de chalcone et de deux heures après traitement de chalcone ont été comparées. On a observé des déplacements de perles induits par les cellules diminuer dans les conditions de chalcone à faible dose et de chalcone à haute dose par rapport aux monocouches HUVEC témoins.
Avant le traitement au chalcone, les tractions RMS étaient d’environ 51 Pascal pour toutes les conditions. Après traitement de chalcone, il y avait une petite augmentation des tractions de RMS à 59 Pascals dans les monolayers traités de chalcone à faible dose et une diminution presque deux fois des tractions rms à 18 Pascals dans les monocouches traitées au chalcone à haute dose par rapport au contrôle. Le traitement de Chalcone a augmenté la magnitude normale moyenne de stress intercellulaire avec la basse dose, mais a sensiblement diminué l’ampleur normale moyenne de stress intercellulaire avec la dose élevée par rapport au contrôle.
Le traitement de chalcone a également diminué les contraintes intercellulaires maximales à la concentration basse et élevée de chalcone par rapport au contrôle. L’impact du traitement au chalcone est statistiquement significatif basé à la fois sur les tests T et le test ANOVA à facteur unique. Tout en plaçant le pochoir PDMS sur le dessus du gel, assurez-vous que le gel est suffisamment sec pour assurer un joint étanche à l’eau entre le pochoir PDMS et le gel.
Ce protocole peut également être appliqué pour sonder la contribution biomécanique d’une variété de jonctions cellule-cellule, protéines cytosquelettiques, molécules d’adhérence de matrice cellulaire, ou molécules extracellulaires avec l’imagerie vivante. Avec ce protocole in vitro, les chercheurs peuvent maintenant étudier avec succès une foule de propriétés biomécaniques, ainsi que biochimiques pendant la réparation des tissus, la cicatrisation des plaies ou les métastases cancéreuses sans modèle animal. Nous conseillons à nos téléspectateurs d’être très prudents lors de la manipulation de chalcone et DMSO que l’inhalation de ces médicaments est signalé comme étant nocif.
