هذا البروتوكول هو إثبات أننا يمكن الآن تحديد تأثير مثبطات الميغراتية بالتفصيل في نماذج السرطان 3D. الميزة الرئيسية هي السهولة والنهج الكل في واحد التي يمكن تنفيذ هذه التقنية. تسمح هذه التقنية بتقييم الأدوية الميغراتستية في أبحاث السرطان في بيئة ثلاثية الأبعاد ، مما يسمح باختبار الأدوية في بيئة أكثر ملاءمة للورم.
ويمكن تطبيق هذه الطريقة على اختبار العقاقير السامة للخلايا في السرطان، أو، على سبيل المثال، لتقييم أثر الإشعاع على انتشار السرطان وهجرة الخلايا. من المفيد ممارسة خطوة الإزالة المتوسطة واستبدال الكولاجين مع لوحات 96-well العادية لتصبح واثقة. أيضا، التدريب على المجهر confocal أمر ضروري.
إن العرض المرئي لهذه التقنية أمر بالغ الأهمية بالنسبة للباحثين لفهم المعالجة الدقيقة المطلوبة للـ spheroids واستخدامها في المجهر confocal. في اليوم الأول من التجريب، لديك متوسطة الثقافة القياسية، في هذه الحالة، U251، جاهزة لخط الخلية المناسبة. في غطاء لثقافة الأنسجة، إضافة 0.5 ملليلتر من التربسين في الثقافة ل تريبسينيزي الخلايا السرطانية.
عد الخلايا السرطانية على مقياس الهيموسيت، وتمييع تركيز خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الثالثة لكل ملليلتر. الحفاظ على تعليق الخلية في أنابيب عالمية مسمّاة بوضوح. إعادة تعليق الخلايا عن طريق عكس لطيف لتجنب تكتل الخلايا.
استخدام ماصة لإضافة 200 ميكرولترات من ثقافة الخلية إلى كل بئر في لوحة 96-جيدا. أضف 200 ميكرولترات من 1X PBS إلى كل بئر فارغ لتجنب التبخر. احتضان الخلايا في حاضنة في 37 درجة مئوية.
بعد 24 ساعة، تحقق من الخلايا عن طريق المجهر مشرق المجال. خطوط الخلية مثل خطوط الخلايا السرطانية جليوما تشكيل spheroids في الجزء السفلي من البئر في غضون 24 ساعة. احتضان spheroids لمدة 48 ساعة أخرى للسماح للهندسة الخلوية 3D لتشكيل.
في اليوم الثالث، ضع الكولاجين، متوسط الثقافة 5X، هيدروكسيد الصوديوم واحد المولر، وأنبوب واحد 20 ملليلتر على الجليد. بعناية وببطء إضافة 10.4 ملليلتر من الكولاجين البارد في أنبوب الثقافة المبردة. تجنب الفقاعات.
ثم، إضافة بلطف 1.52 ملليلتر من الباردة معقم 5X ثقافة المتوسطة. تجنب الفقاعات. قبل الاستخدام فقط، أضف بلطف 72 ميكرولترات من هيدروكسيد الصوديوم المبرد المعقم، والحفاظ على المحلل على الجليد.
مزيج بلطف عن طريق الأنابيب وتجنب فقاعات. يؤدي الخلط الفعال إلى تغيير اللون من الأحمر إلى اللون البرتقالي والأحمر في الوسط. اترك الخليط على الجليد حتى الاستخدام.
بعد ذلك ، لإزالة 190 ميكرولترات من السوبر من لوحة 96 جيدا أعدت في اليوم الأول ، واستخدام ماصة في زاوية نحو جانب البئر. كن حذرا جداً عدم إزعاج spheroids التي تشكلت في الجزء السفلي من البئر. أضف بلطف 100 ميكرولترات من مزيج الكولاجين إلى كل بئر ، وينطّط أسفل جانب البئر.
تجنب الفقاعات وأي اضطراب كروي. احتفظ بأي مزيج كولاجين متبقي في أنبوب 20 ملليلتر في درجة حرارة الغرفة لتقييم البلمرة. احتضان لوحة في الحاضنة لمدة 10 دقائق على الأقل للسماح للكولاجين البلمرة.
عندما يصبح بقايا الكولاجين شبه مُجَمَّدًا ويشبه الإسفنج ، تكون الـ spheroids جاهزة للعلاج بالمثبط. إضافة مثبطات في تركيز 2X إلى خمسة ملليلتر من المتوسطة الثقافة. Pipette 100 ميكرولترات من المتوسطة بلطف أسفل الجانب من كل بئر لتجنب اضطراب spheroid.
مراقبة وصورة كل spheroid عن طريق المجهر حقل مشرق في أوقات ساعة الصفر، 24 ساعة، 48 ساعة، و 72 ساعة لتقييم نشاط المخدرات. ثم، إعادة لوحة إلى الحاضنة. الآن، ضع اللوحة في غطاء لثقافة الأنسجة، واستبدل بلطف المابير مع 100 ميكرولترات من 1X PBS.
الحرص على عدم إزعاج spheroid، وتجنب لمس الكولاجين. كرر هذه الخطوة غسل ثلاث مرات أخرى. إزالة الغسيل النهائي في كل بئر، واستبدالها مع 100 ميكرولترات من 4٪ الفورمالديهايد في 1X PBS.
ضع لوحة 96-well على مقعد مختبر، وتغطية مع احباط، وترك لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي، قم بإزالة الفورمالديهايد بعناية، واستبدله بـ 1X PBS. كرر هذا غسل ثلاث مرات أخرى.
ثم، استبدال 1X PBS غسل مع 100 ميكرولترات من حل تريتون X-100 أعدت حديثا. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في غضون ذلك، إعداد حل حجب مع 50 ملليلتر من 1X PBS و 05٪ مسحوق الحليب منزوع الدسم في أنبوب 50 ملليلتر، واخلط جيدا.
بعد 30 دقيقة، قم بإزالة Triton X-100، واغسل ثلاث مرات باستخدام PBS 1X. إضافة 100 ميكرولترات من الحل حظر لكل بئر، واحتضان لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، تمييع الأجسام المضادة للماوس IgG acetylated الاسيتيلين في العازلة حظر بنسبة واحد إلى 100.
الطرد المركزي الأولية لعرقلة الجسم الخليط العازلة لمدة خمس دقائق في 15، 682 مرات ز. إزالة بعناية حل حجب في كل بئر، وإضافة 25 إلى 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة حظر العازلة الفائقة من الأنبوب. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
ثم، إزالة حل الأجسام المضادة من كل بئر، وغسل ثلاث مرات مع 100 ميكرولترات من 1X PBS. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية في العازلة منع في التركيز الموصى بها بالإضافة إلى أي بقع الفلورسنت إضافية. مرة أخرى، الطرد المركزي حل الأجسام المضادة الثانوية لمدة خمس دقائق في 15، 682 مرات ز.
إزالة حل حظر من كل بئر، وإضافة 25 إلى 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية سوبرنات. احتضان في الظلام لمدة 1 1/2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المحلل صبغ الأجسام المضادة الثانوية، وغسل ثلاث مرات مع 1X PBS، 100 ميكرولترس في البئر.
ارفع بعناية مقابس الكولاجين الفردية عن طريق الشفط مع ماصة بلاستيكية 200 ميكرولتر على وسط شريحة زجاجية. إضافة قطرة واحدة من mountant مناسبة لتغطية الكولاجين المكونات. ضع غطاءً على أعلى العينة، ثم قم بتخزين الشريحة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
تكنولوجيا الزفويد ثلاثية الأبعاد هو تعزيز فهم التفاعلات المخدرات ورم لأنها أكثر تمثيلا للبيئة الخاصة بالسرطان. وفي هذه الدراسة، تم الكشف عن آثار محتملة مضادة للهجرة أو مؤيدة لها. هذا ملحوظ بشكل خاص في KNS42 مع يبدو لا ترحيل في عنصر التحكم أو spheroids المعالجة.
ولوحظ موت الخلايا في أعلى تركيز مثبطات 10 ميكرومولار. وكان التجزؤ النووي والخلايا المهاجرة واضحين في خلايا U251. وكان U251 الخلايا spheroids المسامير تشع بعيدا عن الزفير الأصلي، مع زيادة التقريب الخلية في الخلايا واضحة مع زيادة تركيز المانع.
ولوحظ انهيار المنشآت الصغيرة والتفتت النووي في KNS42. تشير نتوءات ورقة مع طفرات خلية مفردة إلى ترحيل KNS42. في أدنى تركيز مثبطات، كان هذا النمط الظاهري واضحًا ولكنه فُقد مع زيادة تركيز المثبطات.
من المهم أن تترك جميع الكواشف على الجليد حتى تصبح جاهزة. خلاف ذلك، يبدأ الكولاجين البلمرة قبل أن يتم إضافة كل ذلك إلى الـ spheroids. هناك مجال لتحديد حجم الصور الناتجة عن المجهر الناسخة لتقييم آثار، على سبيل المثال، المخدرات الميغراتاتتيكية على مورفولوجيا الخلية.
وقد سمح لنا، للمرة الأولى، بتأكيد تأثير مثبطات الميجرستاتيكي MI-192 على مستويات أسيتيل ميكروتومومي واستكشاف هذا الأمر بشكل أكبر من حيث هجرة الخلايا. وينبغي توخي المزيد من الحذر عند التعامل مع الفورمالديهايد لخطوة التثبيت. تطبق الإرشادات المعتادة للصحة والسلامة.
