يصف هذا البروتوكول ثلاثة في المختبر المختبرات التي تقوم بشكل جماعي بتقييم وظائف الخلايا البطانية الدموية البشرية وتفاعلها مع الزناة GABAergic البشرية. النتائج من هذه المقايسات سوف توفر نظرة نقدية في العلاقة بين الخلايا البطانية البطانية الدموية واضطرابات الدماغ. هذه المقايسات بسيطة ومنخفضة التكلفة وتسمح بقياس هجرة الخلايا في نطاق السنتيمترات ، وهو ما لا يتحقق من قبل المقاييس الموجودة الأخرى.
ترتبط العيوب في الهجرة وتوزيع المتدربين GABAergic باضطرابات نفسية ، مثل التوحد والصرع والفصام والاكتئاب. ولذلك، فمن الأهمية بمكان لدراسة تفاعل الخلايا البطانية البطانية الدموية مع الاضطرابات الزناة في سياق الإنسان لمعالجة التسبب في هذه الاضطرابات. تبدأ من خلال إعداد الخلايا البشرية للتشايس.
السماح للخلايا البطانية البطية الدموية البشرية لتصل إلى 70 إلى 80٪ التقاء ثم فصلها وفقا لاتجاهات المخطوطة ، وبعد عدها باستخدام طريقة استبعاد trypan الأزرق. لإعداد صابونات GABAergic الإنسان، حل تفكك الخلايا الدافئة و aliquot من وسط الخلايا العصبية في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم التعرق المتوسطة من كل بئر تحتوي على خلايا وغسلها مع ملليمتر واحد من برنامج تلفزيوني في بئر.
فصل الخلايا عن طريق إضافة 0.5 ملليلتر من محلول الانفصام قبل الاستنشاق في البئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، إضافة ملليلتر واحد من الوسط العصبي في البئر ونقل حل الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، triturating بلطف لتفكك كتل الخلية. الطرد المركزي الخلايا في 380 مرات G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وpirpirate ة فائقة و resuspend بيليه الخلية في ملليلتر واحد من الوسط العصبي.
ثم عد الخلايا الحية باستخدام استبعاد trypan الأزرق. إعداد السيطرة على الخلايا البطانية البشرية عن طريق تسخين حل تفكك الخلية و aliquot من وسط البطانية في 37 درجة مئوية، 10 دقائق قبل الاستخدام. متوسطة من كل بئر وغسلها مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في بئر.
فصل الخلايا عن طريق إضافة 0.5 ملليلتر من حل التفكك قبل الدفء إلى كل بئر واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم، إضافة ملليلتر واحد من وسط الخلية البطانية في بئر لتحييد حل التفكك، ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. الطرد المركزي الخلايا في 200 مرة G لمدة خمس دقائق، وpirerate فائقة و resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من وسط الخلية البطانية.
ثم استخدم طريقة الاستبعاد trypan لحساب الخلايا. إعداد واحد جيدا إدراج الثقافة عن طريق قطع ثلاثة جوانب من بئر واحد من اثنين من ثقافة السيليكون جيدا إدراج مع شفرة معقمة. قم بإزالة الإدراج مع ملاقط معقمة وضعه في وسط طبق بولي-L-ornithine ومغلفة باللامينين، ثم اضغط على طول حافة إدراج لإصلاحه على السطح.
بعناية بدوره طبق رأسا على عقب للتحقق من أن يتم التقيد بقوة إدراج، ووضع علامة على حدود حجرة إدراج باستخدام سوق سوداء دائمة مع طرف غرامة فائقة. تعليق interneurons GABAergic الإنسان في الخلايا العصبية المتوسطة والبشرية البطانية البطانية والخلايا البطانية المتوسطة بتركيز 30، 000 لكل 70 ميكرولتر، ثم البذور 70 ميكرولترات من حل الخلية داخل كل واحد إضافة ثقافة جيدا. إضافة ملليلتر واحد من الوسط العصبي إلى طبق الخلايا العصبية لملء المنطقة المحيطة بإدراج ومنع الطلاء من التجفيف.
وبالمثل، إضافة ملليلتر واحد من متوسطة الخلية البطانية إلى طبق الخلية البطانية البطانية. تحقق من الخلايا تحت المجهر للتحقق من أنها لا تسرب من حجرة إدراج، ثم احتضان لهم في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة، تحقق من الخلايا مرة أخرى تحت المجهر للتحقق من أنها قد تعلق بشكل صحيح.
بعد 48 ساعة من البذر، قم بإزالة الـ insert بلطف باستخدام ملاقط معقمة وتحقق من الخلايا تحت المجهر للتحقق من أن طبقة الخلية لا تزال دون عائق. إزالة المتوسطة من كل من الخلايا العصبية وأطباق الخلايا البطانية البطانية الاديلية، وإضافة ملليلتر واحد من المتوسطة الطازجة إلى كل طبق. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمسة أيام.
ثم، إزالة المتوسطة، وإصلاح الخلايا مع 4٪ PFA لمدة 10 دقائق وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. لأداء فحص الثقافة المشتركة، تعليق 30،000 GABAergic interneurons و 30،000 الخلايا البطانية البطانية الدموية البشرية في 70 ميكرولترات من المتوسط ثقافة المشتركة، ثم بذور هذا الحل الخلية داخل مقصورة واحدة إدراج جيدا. بعد 48 ساعة، قم بإزالة الإدراج.
احتضان الثقافة المشتركة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمسة أيام. بعد الحضانة، وإزالة المتوسطة، وإصلاح الخلايا مع 4٪ PFA وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. لأداء فحص العلاج الكيميائي الجذب، ووضع ثلاثة ثقافة جيدة إدراج في وسط البولي L-ornithine وطبق المغلفة لامينين 35 ملليمتر، بدوره الطبق رأسا على عقب، ووضع علامة على الحدود حول المقصورة الوسطى من إدراج باستخدام علامة دائمة مع طرف غرامة جدا.
البذور 30، 000 جابارجي interneurons في 70 ميكرولترات من وسط الخلايا العصبية في المقصورة الوسطى، ثم البذور 10، 000 الخلايا البطانية البطانية الدوئية و 10، 000 السيطرة على الخلايا البطانية و 70 ميكرولترات من المتوسطة كل منهما في المقصورتين الخارجيتين. أضف ملليلتر واحد من الوسط المشترك على طول جانب الطبق لمنع الطلاء على الطبق من التجفيف. بعد 48 ساعة، وإزالة إدراج واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 36 ساعة.
بعد الحضانة، وإزالة المتوسطة، وإصلاح الخلايا وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. تم استخدام مقايسات الهجرة لمسافات طويلة والثقافة المشتركة للتحقيق في التفاعلات بين الخلايا البطانية البطانية الدامجة والخلايا العصبية GABAergic. في اختبار الهجرة لمسافات طويلة، بدأت الخلايا كرقعة مستطيلة في اليوم صفر، ولكن بحلول 48 ساعة، كانوا قد هاجروا إلى مساحة خالية من الخلايا.
لم يظهر التلطيخ المناعي الكيميائي مع الأجسام المضادة Caspase-3 المضادة، وهي علامة على موت الخلايا المبرمج، أي إشارة المبرمج في الخلايا العصبية المصنفة. في فحص الهجرة المشتركة الثقافة، عندما تم زرع interneurons المشتركة مع الخلايا البطانية البطانية الدموية البشرية، والخلايا العصبية قطعت مسافات أبعد بالمقارنة مع عندما تم بذر interneurons وحدها أو عندما شارك في البذور مع الخلايا البطانية السيطرة. في فحص جذب العلاج الكيميائي ، هاجر عدد أكبر بكثير من interneurons نحو الخلايا البطانية الدموية مقارنة بالخلايا البطانية التحكم ، مما يؤكد أن interneurons GABAergic تستجيب بشكل انتقائي لإشارات العلاج الكيميائي الجذابة التي تفرزها الخلايا البطانية البطانية الدموية.
يمكن تعديل هذه المقايسات باستخدام اليغانندات أو مثبطات أو أنيس للحصول على رؤى ميكانيكية في تفاعلات الخلايا البطانية البطانية الدموية البشرية مع التورين البشري. كما يمكن استخدامها لدراسة تفاعل الخلايا البطانية الدموية البشرية مع الخلايا العصبية الأخرى كما ذكرت مجموعتنا وغيرها. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم لإصلاح إدراج بحزم على الطبق والاحتفاظ بها دون عائق في جميع أنحاء الفحص، وإلا فإنه قد يؤدي إلى تسرب الخلية، مفرزة الخلية أو عدم المحاذاة من إدراج مع الحدود المرسومة.
وقد أشار عملنا الخلية دورا مستقلا من الخلايا البطانية الدموية البشرية في التسبب في الاضطرابات النفسية مثل الفصام والصرع والتوحد. وبالتالي فإن هذه المقايسات تسمح بتقييم الخلايا البطانية البطية البطية الدموية المريضة المستمدة من المرضى الذين يعانون من هذه الاضطرابات باستخدام تقنية IPSC.
