Dieses Protokoll beschreibt drei In-vitro-Assays, die gemeinsam die Funktionen menschlicher periventrikulärer Endothelzellen und deren Wechselwirkung mit humanen GABAerge Interneuronen bewerten. Die Ergebnisse dieser Assays werden einen kritischen Einblick in den Zusammenhang zwischen periventrikulären Endothelzellen und Hirnerkrankungen geben. Diese Assays sind einfach, kostengünstig und ermöglichen die Messung der Zellmigration im Bereich von Zentimetern, was durch andere bestehende Assays nicht erreicht wird.
Defekte in der Migration und Verteilung von GABAerge Interneurons sind mit psychiatrischen Störungen, wie Autismus, Epilepsie, Schizophrenie und Depression verbunden. Daher ist es wichtig, die Wechselwirkung von periventrikulären Endothelzellen mit GABAergen Interneuronen im menschlichen Kontext zu untersuchen, um die Pathogenese dieser Störungen anzugehen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung menschlicher Zellen für den Test.
Lassen Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen 70 bis 80 % Konfluenz erreichen, dann dissoziieren Sie sie entsprechend den Anweisungen des Manuskripts und zählen Sie sie mit der Trypan-Blau-Ausschlussmethode. Zur Vorbereitung menschlicher GABAerge Interneurons, warmer Zelldissoziationslösung und einem Aliquot von neuronalen Medien bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Dann das Medium aus jedem Brunnen, der Zellen enthält, ansaugen und mit einem Millimeter PBS pro Brunnen waschen.
Lösen Sie die Zellen, indem Sie 0,5 Milliliter vorgewärmte Dissoziationslösung pro Brunnen hinzufügen und sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation einen Milliliter neuronalen Mediums pro Brunnen hinzufügen und die Zelllösung in eine 15-Milliliter-Konustube übertragen, die sanft trituiert, um Zellklumpen zu dissoziieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 380 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter neuronalen Mediums wieder auf.
Zählen Sie dann die lebenden Zellen mit Trypan-Blau-Ausschluss. Bereiten Sie die Kontrolle menschlicher Endothelzellen vor, indem Sie die Zelldissoziationslösung und ein Aliquot von endothelialem Medium bei 37 Grad Celsius, 10 Minuten vor der Anwendung, erwärmen. Von jedem Brunnen absaugen und mit einem Milliliter PBS pro Brunnen waschen.
Lösen Sie die Zellen, indem Sie 0,5 Milliliter der vorgewärmten Dissoziationslösung zu jedem Brunnen hinzufügen und die Platte fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie dann einen Milliliter Endothelzellmedium pro Brunnen hinzu, um die Dissoziationslösung zu neutralisieren, und übertragen Sie die Zellen in eine 15 Milliliter konische Röhre. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G für fünf Minuten, aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Endothelzellmedium.
Verwenden Sie dann die Trypan-Ausschlussmethode, um die Zellen zu zählen. Bereiten Sie einen Brunnen Kultureinsatz vor, indem Sie drei Seiten eines Brunnens eines zwei gut Silikonkultureinsatzes mit einer sterilen Klinge schneiden. Entfernen Sie den Einsatz mit einer sterilen Pinzette und legen Sie ihn in die Mitte einer Poly-L-Ornithin- und Laminin-beschichteten Schale, und drücken Sie dann entlang der Kante des Einsatzes, um ihn an der Oberfläche zu befestigen.
Drehen Sie die Schale vorsichtig auf den Kopf, um zu überprüfen, ob der Einsatz fest verkrüppft ist, und markieren Sie die Grenze des Einsatzfachs mit einem permanenten Schwarzmarkt mit einer ultrafeinen Spitze. Suspend humane GABAerge Interneuronen in neuronalen medium und humanen periventrikulären Endothelzellen und Endothelzellmedium in einer Konzentration von 30.000 pro 70 Mikroliter, dann Samen 70 Mikroliter der Zelllösung in jedem Brunnen Kultureinsatz. Fügen Sie der Neuronenschale einen Milliliter neuronales Medium hinzu, um den Bereich um den Einsatz zu füllen und das Trocknen der Beschichtung zu verhindern.
In ähnlicher Weise fügen Sie der periventrikulären endothelialen Zellschale einen Milliliter Endothelzellmedium hinzu. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob sie nicht aus dem Einsatzraum auslaufen, und bebrüten sie dann 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Überprüfen Sie nach der Inkubation die Zellen erneut unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob sie richtig befestigt sind.
48 Stunden nach der Aussaat den Einsatz vorsichtig mit einer sterilen Pinzette entfernen und die Zellen unter dem Mikroskop überprüfen, um zu überprüfen, ob die Zellschicht ungestört bleibt. Entfernen Sie das Medium aus dem Neuron und den periventrikulären endothelialen Zellschalen, und fügen Sie jedem Gericht einen Milliliter frisches Medium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für fünf Tage.
Entfernen Sie dann das Medium, fixieren Sie die Zellen mit 4%PFA für 10 Minuten und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Um den Co-Kultur-Assay durchzuführen, setzen Sie 30.000 GABAerge Interneurons und 30.000 menschliche periventrikuläre Endothelzellen in 70 Mikroliter Co-Kulturmedium aus, säen Sie dann diese Zelllösung in einem einbrunnen insert-Fach. Entfernen Sie nach 48 Stunden den Einsatz.
Inkubieren Sie die Co-Kultur bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für fünf Tage. Nach der Inkubation entfernen Sie das Medium, fixieren Sie die Zellen mit 4%PFA und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Um den Chemo-Attraktions-Assay durchzuführen, legen Sie einen drei Brunnenkultureinsatz in die Mitte einer Poly-L-Ornithin- und Laminin-beschichteten 35-Millimeter-Schale, drehen Sie die Schale auf den Kopf und markieren Sie die Grenze um das mittlere Fach des Einsatzes mit einem permanenten Marker mit einer ultrafeinen Spitze.
Samen 30 000 GABAerge Interneurons in 70 Mikroliter neureszenumsimim, dann Samen 10.000 periventrikuläre Endothelzellen und 10.000 Kontroll-Endothelzellen und 70 Mikroliter ihres jeweiligen Mediums in den beiden Äußeren. Fügen Sie einen Milliliter Co-Kulturmedium entlang der Seite der Schale hinzu, um zu verhindern, dass die Beschichtung auf der Schale trocknet. Nach 48 Stunden entfernen Sie den Einsatz und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 36 Stunden.
Nach der Inkubation entfernen Sie das Medium, fixieren Sie die Zellen und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Langstrecken- und Co-Kultur-Migrations-Assays wurden verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen periventrikulären Endothelzellen und GABAergen Neuronen zu untersuchen. Im Fernmigrationstest begannen Zellen als rechteckiger Patch am Tag Null, aber um 48 Stunden waren sie in den zellfreien Raum hinausgewandert.
Immunzytochemische Färbung mit Anti-Active Caspase-3 Antikörper, ein Marker der Apoptose, zeigte kein apoptotisches Signal in den gesäten Neuronen. Im Co-Kultur-Migrationstest, als Interneuronen mit menschlichen periventrikulären Endothelzellen ko-saatiert wurden, legten Neuronen weiter entfernt ezielflich als bei interneuronen, die allein ausgesät wurden oder wenn sie mit Kontrollendothelzellen ausgesät wurden. Im Chemo-Attraktionstest wanderte eine signifikant höhere Anzahl von Interneuren in periventrikuläre Endothelzellen im Vergleich zu Kontrollen von Endothelzellen, was bestätigt, dass GABAerge Interneuronen selektiv auf chemoattraktive Cues reagieren, die von periventrikulären Endothelzellen sezerniert werden.
Diese Assays können mit Liganden, Inhibitoren oder Assay-Arenen modifiziert werden, um mechanistische Einblicke in Wechselwirkungen menschlicher periventrikulärer Endothelzellen mit menschlichen Interneuronen zu erhalten. Sie können auch verwendet werden, um die Interaktion von menschlichen periventrikulären Endothelzellen mit anderen neuronalen Zellen zu untersuchen, wie von unserer Gruppe und anderen berichtet. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, den Einsatz fest auf der Schale zu fixieren und ihn während des gesamten Testes ungestört zu halten, da es sonst zu Zelllecks, Zellablösung oder Fehlausrichtung des Einsatzes mit der gezogenen Grenze führen kann.
Unsere Arbeit hat eine zellautonome Rolle menschlicher periventrikulärer Endothelzellen bei der Pathogenese von psychiatrischen Störungen wie Schizophrenie, Epilepsie und Autismus gezeigt. Diese Assays ermöglichen daher die Beurteilung von erkrankten periventrikulären Endothelzellen, die von Patienten mit diesen Störungen mit der IPSC-Technologie abgeleitet wurden.
