Этот протокол описывает три анализа in vitro, которые коллективно оценивают функции перивентрикулярных эндотелиальных клеток человека и их взаимодействие с человеческими ГАМК-интернейронами. Результаты этих анализов обеспечат критическое понимание связи между перивентрикулярными эндотелиальными клетками и нарушениями мозга. Эти анализы просты, недороги и позволяют измерять миграцию клеток в диапазоне сантиметров, чего не достигается другими существующими анализами.
Дефекты в миграции и распределении ГАМК-интернейронов связаны с психическими расстройствами, такими как аутизм, эпилепсия, шизофрения и депрессия. Поэтому крайне важно изучить взаимодействие перивентрикулярных эндотелиальных клеток с ГАМК-интернейронов в человеческом контексте для решения патогенеза этих расстройств. Начните с подготовки человеческих клеток к анализу.
Разрешить человеку перивентрикулярных эндотелиальных клеток достичь 70 до 80% слияния затем разъедижевать их в соответствии с указаниями рукописи и считать их с помощью метода trypan синий исключения. Для подготовки гибергических интернейронов человека в течение 10 минут в течение 10 минут разогреть раствор диссоциации клеток и алицита нейронной среды при 37 градусах цельсия. Затем аспирировать среду из каждого хорошо содержащие клетки и мыть их с одним миллиметром PBS на колодец.
Отсоедините клетки, добавив 0,5 миллилитров довоенной диссоциации раствора на колодец и инкубации их при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. После инкубации добавьте один миллилитр нейронной среды на колодец и перенесите клеточный раствор в 15 миллилитровую коническую трубку, мягко тритурируя, чтобы разъедать клеточные сгустки. Центрифуга клеток в 380 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре, аспирировать супернатант и повторного выемки гранулы клетки в один миллилитр нейронной среды.
Затем посчитайте живые клетки, используя trypan голубое исключение. Подготовка контроля человеческих эндотелиальных клеток путем потепления клеточного раствора диссоциации и aliquot эндотелиальной среды при 37 градусов по Цельсию, за 10 минут до использования. Аспират среды из каждого хорошо и мыть их с одним миллилитров PBS на колодец.
Отсоедините клетки, добавив 0,5 миллилитров довоенной диссоциации раствора для каждой хорошо и инкубации пластины при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем добавьте один миллилитр эндотелиальной клеточной среды на колодец, чтобы нейтрализовать раствор диссоциации, и перенесите клетки в 15-миллилитровую коническую трубку. Центрифуга клетки в 200 раз G в течение пяти минут, аспирировать супернатант и повторного перерасхода клеток в один миллилитр эндотелиальной клеточной среды.
Затем используйте метод исключения трипана для подсчета ячеек. Подготовьте одну хорошо культурную вставку, разрезая три стороны одного колодец из двух хорошо силиконовой культуры вставки с стерильным лезвием. Снимите вставку стерильным пинцетом и поместите ее в центр поли-L-орнитина и ламинина покрытием блюдо, а затем нажмите вдоль края вставки, чтобы исправить его на поверхность.
Аккуратно переверни блюдо с ног на голову, чтобы убедиться, что вставка прочно прилипла, и отметьте границу вставного отсека с помощью постоянного черного рынка с ультра тонкой наконечником. Приостановить человека ГАМК межнейронов в нейронной среде и человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток и эндотелиальной клеточной среды в концентрации 30000 на 70 микролитров, а затем семян 70 микролитров клеточного раствора внутри каждого хорошо культуры вставить. Добавьте один миллилитр нейронной среды в блюдо нейрона, чтобы заполнить область вокруг вставки и предотвратить покрытие от высыхания.
Аналогичным образом, добавьте один миллилитр эндотелиальной клеточной среды к перивентрикулярной эндотелиальной клеточной тарелке. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они не протекают из вставки отсека, а затем инкубировать их при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 24 часов. После инкубации проверьте клетки снова под микроскопом, чтобы убедиться, что они должным образом прикреплены.
Через 48 часов после посева аккуратно удалите вставку стерильным пинцетом и проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что клеточный слой остается нетронутым. Удалите среду как из нейрона, так и из перивентрикулярных эндотелиальных клеточных блюд и добавьте по миллилитр свежей среды к каждому блюду. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение пяти дней.
Затем удалите среду, исправить клетки с 4%PFA в течение 10 минут и мыть их три раза с PBS. Для выполнения совместной культуры анализа, приостановить 30000 ГАМК межнейронов и 30000 человека periventricular эндотелиальных клеток в 70 микролитров со-культуры среды, а затем семян этого клеточного раствора внутри одного хорошо вставить отсек. Через 48 часов снимите вставку.
Инкубировать совместно культуры на 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение пяти дней. После инкубации, удалить среду, исправить клетки с 4%PFA и мыть их три раза с PBS. Для выполнения химио-притяжения анализа, поместите три хорошо культуры вставить в центре поли-L-орнитин и ламинин покрытием 35 миллиметров блюдо, поверните блюдо вверх дном, и пометить границу вокруг среднего отсека вставки с помощью постоянного маркера с ультра тонкой наконечником.
Семя 30 000 ГАМК интернейронов в 70 микролитров нейронной среды в среднем отсеке, затем семена 10 000 перивентрикулярных эндотелиальных клеток и 10 000 контрольных эндотелиальных клеток и 70 микролитров их соответствующей среды в двух внешних отсеках. Добавьте один миллилитр со-культуры среды вдоль стороны блюда, чтобы предотвратить покрытие на блюдо от высыхания. После 48 часов, удалить вставку и инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 36 часов.
После инкубации, удалить среды, исправить клетки и мыть их три раза с PBS. Для исследования взаимодействий между перивентрикулярными эндотелиальными клетками и ГАМК были использованы анализы миграции на большие расстояния и совместно культуры. В анализе миграции на большие расстояния клетки начинали как прямоугольный патч на нулевом дне, но к 48 часам они мигрировали в пространство, свободное от клеток.
Иммуноцитохимическое окрашивание антителами Anti-Active Caspase-3, маркером апоптоза, не показало апоптотического сигнала в семенных нейронах. В совместной культуре миграции анализа, когда интернейроны были совместно посеяны с человеком periventricular эндотелиальных клеток, нейроны путешествовали дальше расстояния по сравнению с когда интернейроны были посеяны в одиночку или когда совместно посеяны с контрольными эндотелиальными клетками. В химио-притяжения анализа, значительно большее число интернейронов мигрировали в направлении перивентрикулярных эндотелиальных клеток по сравнению с контрольных эндотелиальных клеток, подтверждая, что ГАМК-интернейроны реагируют выборочно на химио-привлекательные сигналы выделяется перивентрикулярных эндотелиальных клеток.
Эти анализы могут быть изменены с помощью лигандов, ингибиторов или анализов, чтобы получить механистическое понимание взаимодействий человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток с человеческими интернейронами. Они также могут быть использованы для изучения взаимодействия человека periventricular эндотелиальных клеток с другими нервными клетками, как сообщается нашей группы и других. При попытке этой процедуры, важно, чтобы исправить вставку твердо на блюдо и держать его спокойно на протяжении всего анализа, в противном случае это может привести к утечке клеток, отслоение клеток или несогласованность вставки с нарисованной границы.
Наша работа показала клеточную автономную роль перивентрикулярных эндотелиальных клеток человека при патогенезах психических расстройств, таких как шизофрения, эпилепсия и аутизм. Таким образом, эти анализы позволят оценить больные перивентрикулярные эндотелиальные клетки, полученные от пациентов с этими расстройствами с использованием технологии IPSC.
