이 프로토콜은 인간 심실 내피 세포의 기능과 인간 GABAergic interneurons와의 상호 작용을 종합적으로 평가하는 3개의 체외 분석서를 설명합니다. 이 assays에서 결과는 심실 내피 세포와 두뇌 무질서 사이 링크에 중요한 통찰력을 제공할 것입니다. 이러한 저법은 간단하고 저렴한 비용으로 다른 기존 에세이에 의해 달성되지 않는 센티미터 범위에서 세포 이동을 측정할 수 있습니다.
GABAergic interneurons의 이주 및 분포에 있는 결점은 자폐증, 간질, 정신 분열증 및 불경기와 같은 정신 장애와 연관됩니다. 따라서, 이러한 장애의 발병을 해결하기 위해 인간의 맥락에서 GABAergic interneurons와 periventriricular 내피 세포의 상호 작용을 연구하는 것이 중요합니다. 분석에 대한 인간 세포를 준비하여 시작합니다.
인간 대기실 내피 세포가 70~80%의 합류에 도달한 다음 원고의 지시에 따라 해리하여 trypan blue 배제 방법을 사용하여 계산하도록 허용합니다. 인간 GABAergic 인터뉴런을 준비하려면, 따뜻한 세포 해리 액스와 10 분 동안 섭씨 37도에서 신경 매체의 알리쿼트. 그런 다음 세포를 포함하는 각 우물에서 배지를 흡인하고 잘 당 PBS의 1 밀리미터로 씻어.
우물당 0.5 밀리리터의 예온 된 해리 용액을 추가하고 5 분 동안 섭씨 37도에서 배양하여 세포를 분리하십시오. 인큐베이션 후, 잘 당 신경 매체의 1 밀리리터를 추가하고 15 밀리리터 원추형 튜브로 세포 용액을 전송, 부드럽게 세포 덩어리를 해리. 실온에서 5분 동안 380배 G의 세포를 원심분리하고, 슈퍼나탄을 흡인시키고, 뉴런 배지의 1밀리리터에서 세포 펠릿을 재연한다.
그런 다음 trypan 파란색 제외를 사용하여 라이브 셀을 계산합니다. 세포 해리 용액과 내피 배지의 알리쿼트(aliquot)를 사용하기 10분 전섭씨 37도에서 따뜻하게 하여 인체 내피 세포를 조절할 수 있다. 각 우물에서 배지를 흡인하고 잘 당 PBS의 1 밀리리터로 씻어.
각 우물에 예온 된 해리 용액의 0.5 밀리리터를 추가하고 5 분 동안 실온에서 플레이트를 배양하여 세포를 분리하십시오. 이어서, 내피 세포 배지의 1밀리리터를 잘 첨가하여 해리 용액을 중화시키고 세포를 15밀리리터 원뿔형 튜브로 이송한다. 세포를 5분 동안 200배 G로 원심분리하고, 수퍼나티를 흡인시키고 내피 세포 배지의 1밀리리터로 세포를 재연한다.
그런 다음 trypan 제외 방법을 사용하여 셀을 계산합니다. 멸균 블레이드를 가진 2개의 잘 실리콘 배양 인서트의 1개의 웰의 3개의 쪽을 절단하여 하나의 웰 배양 인서트를 준비합니다. 멸균 핀셋으로 인서트를 제거하고 폴리 L-ornithine 및 라미닌 코팅 접시의 중앙에 배치한 다음 인서트의 가장자리를 따라 눌러 표면에 고정합니다.
접시를 거꾸로 뒤집어 인서트가 단단히 부착되었는지 확인하고, 초미세 팁이 있는 영구 암시장을 사용하여 인서트 구획의 경계를 표시합니다. 70 마이크로리터 당 30, 000의 농도에서 신경 배지 및 인간 심실 내피 세포 및 내피 세포 배지에서 인간 GABAergic interneurons를 중단한 다음 각 음배양 삽입 내부의 세포 용액의 70 마이크로리터를 시드한다. 뉴런 배지 1밀리리터를 뉴런 접시에 추가하여 삽입 주변 영역을 채우고 코팅이 건조되는 것을 방지합니다.
마찬가지로, 심실 내피 세포 접시에 내피 세포 배지 의 1 밀리리터를 추가합니다. 현미경의 밑에 세포를 확인하여 삽입 구획에서 누출되지 않는지 확인한 다음 섭씨 37도및 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 잠복 후 현미경으로 세포를 다시 확인하여 제대로 부착되었는지 확인하십시오.
파종 후 48시간 후, 멸균 핀셋으로 인서트를 부드럽게 제거하고 현미경으로 세포를 확인하여 세포층이 방해받지 않고 남아 있는지 확인합니다. 뉴런과 심실 내피 세포 접시모두에서 배지를 제거하고 각 접시에 신선한 배지 1 밀리리터를 추가합니다. 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 5일간 배양합니다.
그런 다음, 매체를 제거하고, 세포를 4%PFA로 10분 동안 수정하고 PBS로 세 번 세척합니다. 공동 배양 분석법을 수행하기 위해, 30, 000 GABAergic 인터뉴런 및 30, 000 인간의 periventriricular 내피 세포70 마이크로리터의 공동 배양 배지를 중단한 다음 이 세포 용액을 하나의 잘 삽입 구획 내부에 시드한다. 48시간 후에 인서트를 제거합니다.
5일 동안 공동 배양을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 4%의 PFA로 세포를 수정하고 PBS로 세 번 세척합니다. 화학 어트랙션 분석작업을 수행하려면 폴리 L-ornithine 및 라미닌 코팅 35mm 접시의 중앙에 3개의 웰 배양 인서트를 배치하고, 접시를 거꾸로 뒤집어 초미세 팁이 있는 영구 마커를 사용하여 인서트의 중간 구획 주위에 경계를 표시합니다.
종자 30, 000 GABAergic interneurons 70 중간 구획에 있는 뉴런 배지의 마이크로 리터, 다음 씨앗 10, 000 periventriricular 내피 세포 와 10, 000 제어 내피 세포와 70 두 개의 외부 구획에 그들의 각각의 매체의 마이크로 리터. 접시 의 측면을 따라 공동 배양 매체의 1 밀리리터를 추가하여 접시의 코팅이 건조되는 것을 방지합니다. 48시간 후, 인서트를 제거하고 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 36시간 동안 배양합니다.
인큐베이션 후, 매체를 제거하고 세포를 수정하고 PBS로 세 번 세척합니다. 장거리 및 공동 배양 이동 소는 심실 내피 세포와 GABAergic 뉴런 사이의 상호 작용을 조사하는 데 사용되었습니다. 장거리 마이그레이션 분석에서 세포는 0일째에 직사각형 패치로 시작했지만 48시간으로 셀이 없는 공간으로 마이그레이션했습니다.
세포사멸의 마커인 항활성 Caspase-3 항체를 사용하여 면역세포화학 염색은 종자 뉴런에서 세포사멸 신호를 보이지 않았다. 공동 배양 이동 분석에서 인터뉴런이 인간 심실 내피 세포와 공동 시드되었을 때, 뉴런은 인터뉴런이 단독으로 시드되거나 대조 내피 세포와 공동 시드될 때와 비교하여 더 먼 거리를 여행했습니다. 화학-어트랙션 분석에서, 내피 세포를 제어하는 것에 비해 심실 내피 세포를 향해 이동하는 인터뉴런의 수가 상당히 높으며, GABAergic interneurons가 대기실 내피 세포에 의해 분비된 화학 요법 매력적인 단서에 선택적으로 반응한다는 것을 확인합니다.
이러한 분석안은 인간 간 신경 세포와 인간의 심실 내피 세포의 상호 작용에 대한 기계론적 통찰력을 얻기 위해 리간드, 억제제 또는 분석 아렌을 사용하여 수정될 수 있습니다. 그(것)들은 또한 우리의 단 및 그 외에 의해 보고된 것과 같이 그밖 신경 세포와 인간 심실 내피 세포의 상호 작용을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 접시에 삽입을 단단히 고정하고 분석 전반에 걸쳐 방해받지 않도록 유지하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 구그린 경계로 삽입물의 세포 누설, 세포 분리 또는 정렬 불량으로 이어질 수 있습니다.
우리의 일은 정신 분열증, 간질 및 자폐증 같이 정신 장애의 병기에서 인간 심실 내피 세포의 세포 자율적인 역할을 표시했습니다. 이러한 assays는 그러므로 IPSC 기술을 사용하여 이 무질서를 가진 환자에게서 파생된 병든 심실 내피 세포의 평가를 허용할 것입니다.
