本プロトコルは、ヒトの脳室内皮細胞の機能とヒトGABAergicインターニューロンとの相互作用をまとめて評価する3つのインビトロアッセイについて説明する。これらのアッセイの結果は、脳内皮細胞と脳障害との間のリンクに重要な洞察を提供します。これらのアッセイは、簡単で低コストで、他の既存のアッセイでは達成できないセンチメートルの範囲で細胞移動の測定を可能にする。
GABAergic インターニューロンの移動および分布の欠陥は、自閉症などの精神疾患に関連付けられている, てんかん, 統合失調症とうつ病.したがって、これらの疾患の病因に対処するためには、ヒトの文脈におけるGABAergicインターニューロンとの心室内皮細胞の相互作用を研究することが重要である。まず、アッセイ用のヒト細胞を準備します。
ヒト室膜内皮細胞が70〜80%の合流性に達することを許可し、原稿の指示に従ってそれらを解約し、トリパンブルー排除法を使用してそれらを数える。ヒトGABAergicインターニューロンを調製するために、温かい細胞解離液および37°Cのニューロン培地のアリコートを10分間調製する。その後、細胞を含む各ウェルから培地を吸引し、1ウェルあたり1ミリメートルのPBSで洗浄します。
ウェルあたり0.5ミリリットルのプリウォーム解離溶液を加え、摂氏37度で5分間インキュベートして細胞を取り外します。インキュベーションの後、ウェルごとに1ミリリットルの神経培地を加え、細胞溶液を15ミリリットルの円錐管に移し、細胞塊を解化するように穏やかに三分化する。細胞を室温で5分間Gの380倍に遠心し、上清を吸引し、1ミリリットルの神経培地で細胞ペレットを再懸濁する。
次に、トリパンブルーの除外を使用してライブセルをカウントします。細胞解離液と内皮培地のアリコートを摂氏37度、使用の10分前に温めることで、ヒト内皮細胞をコントロールする準備を行う。各ウェルから培地を吸引し、井戸あたり1ミリリットルのPBSで洗浄します。
各ウェルにプリウォーム解離液の0.5ミリリットルを加え、室温でプレートを5分間インキュベートして細胞を取り外します。次いで、解離液を中和するためにウェルあたり1ミリリットルの内皮細胞培地を加え、細胞を15ミリリットルの円錐管に移した。細胞をGの200倍の5分間遠心分離し、上清を吸引し、1ミリリットルの内皮細胞培地で再懸濁する。
次に、trypan 除外メソッドを使用してセルをカウントします。滅菌ブレードで2つの井戸シリコーン培養インサートの1つのウェルの3つの側面を切断することによって1つのウェル培養インサートを準備します。無菌ピンセットで挿入物を取り外し、ポリL-オルニチンとラミニンコーティングされた皿の中央に置き、挿入物の端に沿って押して表面に固定します。
慎重にチップがしっかりと付着していることを確認するために皿を逆さまにし、超微細な先端を持つ永久的な闇市場を使用して挿入コンパートメントの境界をマークします。神経細胞培地およびヒト脳室内皮細胞および内皮細胞培地中のヒトGABAergicインターニューロンを、70マイクロリットル当たり30,000個の濃度で中断し、その後、各ウェル培養挿入物の中に70マイクロリットルの細胞溶液を播種する。ニューロン皿に1ミリリットルの神経培地を加えて、挿入物の周りの領域を満たし、コーティングが乾燥するのを防ぎます。
同様に、心室内皮細胞皿に1ミリリットルの内皮細胞培地を加える。顕微鏡下で細胞をチェックして、挿入コンパートメントから漏れていないことを確認し、摂氏37度と24時間5%の二酸化炭素でインキュベートします。インキュベーション後、顕微鏡下で細胞をもう一度確認し、適切に取り付けられていることを確認します。
播種後48時間後、無菌ピンセットで挿入物を静かに取り除き、顕微鏡下の細胞をチェックして、細胞層が乱れなくままであることを確認します。ニューロンと心室内皮細胞皿の両方から培地を取り除き、各皿に新鮮な培地を1ミリリットル加えます。5日間、摂氏37度、炭酸ガス5%で細胞をインキュベートします。
その後、培地を取り出し、4%PFAで細胞を10分間固定し、PBSで3回洗浄します。共培養アッセイを行うには、30,000個のGABAERG性インターニューロンおよび30,000個のヒト心膜内皮細胞を70マイクロリットルの共培養培地で中断し、この細胞溶液を1つのウェルインサートコンパートメント内に播種する。48時間後、挿入物を取り外します。
共培養を摂氏37度、炭酸ガス5%5%で5日間インキュベートします。インキュベーション後、培地を取り出し、細胞を4%PFAで固定し、PBSで3回洗浄します。化学引力アッセイを実行するには、ポリL-オルニチンとラミニンコーティングされた35ミリメートル皿の中央に3つのウェルカルチャーインサートを配置し、皿を逆さまにし、超微細な先端を持つ永久的なマーカーを使用してインサートの中央コンパートメントの周りの境界をマークします。
種子30,000GABAERGICインターニューロンは、中間コンパートメント内の神経培地の70マイクロリットルで、次いで、2つの外側のコンパートメント内の各培地の10、000個の心膜内皮細胞および10,000の制御内皮細胞および70マイクロリットルを制御する。皿の側面に沿って1ミリリットルの共培養培地を加えて、皿のコーティングが乾燥するのを防ぎます。48時間後、インサートを取り出し、37°Cで細胞をインキュベートし、36時間二酸化炭素を5%でインキュベートします。
インキュベーション後、培地を取り出し、細胞を固定し、PBSで3回洗浄します。遠距離および共培養移行アッセイは、心室内皮細胞とGABAergicニューロンとの相互作用を調べるのに使用された。長距離移動アッセイでは、細胞はゼロ日目に長方形のパッチとして始まったが、48時間までに無細胞空間に移行した。
アポトーシスのマーカーである抗活性カスパーゼ-3抗体による免疫細胞化学的染色は、シードニューロンにアポトーシスシグナルを示さなかった。共培養移行アッセイでは、インターニューロンをヒト心膜内皮細胞と共播させた場合、ニューロンは、インターニューロンが単独で播種されたとき、または対照内皮細胞と共播したときと比較して、より遠い距離を移動した。化学誘引アッセイでは、内皮細胞の制御と比較して、心膜内皮細胞に向かって移行したインターニューロンの数が有意に多く、GABAergicインターニューロンが、骨膜上皮細胞によって分泌される化学魅力的なキューに選択的に反応することを確認した。
これらのアッセイはリガンド、阻害剤またはアッセイアネスを使用して修飾することができ、ヒトの心室内皮細胞とヒトのインターニューロンとの相互作用に対する機械的な洞察を得ることができる。彼らはまた、私たちのグループや他の人によって報告されるように、他の神経細胞とのヒト室周膜内皮細胞の相互作用を研究するために使用することができます.この手順を試みるとき、皿の上にしっかりと挿入物を固定し、アッセイ全体を通して邪魔されずに保つことが重要であり、そうでなければ、細胞漏れ、細胞剥離または引き出された境界を持つ挿入物のずれにつながる可能性があります。
我々の研究は、統合失調症、てんかんおよび自閉症のような精神疾患の病因におけるヒト心室内皮細胞の細胞自律的役割を示している。したがって、これらのアッセイは、IPSC技術を用いてこれらの障害を有する患者由来の疾患性骨膜内皮細胞の評価を可能にする。
