هذه الطريقة مهمة لأن النماذج العضوية المستمدة من المريض هي أداة قوية وسريعة لدراسة سرطان البنكرياس لأنها تعكس عدم التجانس الجيني والذهني لهذا المرض. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن organoids يمكن عزلها مع معدل نجاح عال من كمية محدودة من السرطان ويمكن توسيعها بسرعة في المختبر لتحليل المصب. دراسة العضيات'استجابة للأدوية السامة للخلايا قد تساعدنا على فهم لماذا تصبح الأورام مقاومة للعلاج وتحديد استراتيجيات العلاج أكثر فعالية.
لبدء هذا الإجراء، استرداد لوحة 12-جيدا المعدة من الحاضنة. مع رافع خلية معقمة، رفع بلطف قبة استخراج غشاء الطابق السفلي بحيث يتم العائمة في وسائل الإعلام كاملة مع التأكد من تجنب كشط الجزء السفلي من البئر. باستخدام ماصة P1000، قم بنقل قبة BME والوسائط بعناية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
كرر هذه الخطوة لكل إضافة تحتوي على الجهاز. غسل بلطف كل بئر التي تم حصادها مع ملليلتر واحد من وسائل الإعلام القاعدية الباردة ونقل هذا الغسيل إلى أنبوب يحتوي على organoids. خلط شامل الحل والأعضاء مع ماصة P1000 وتدور في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق.
طبقة من BME تحتوي على organoids في التعليق وبيليه organoid سوف تظهر في الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة بعناية فائقة التأكد من تجنب أي خسارة من طبقة BME وعضوي. ضع الأنبوب على الجليد.
إضافة 10 ملليلتر من الجليد محلول استرداد الخلايا الباردة إلى الأنبوب ومزيج دقيق من قبل الانقلاب. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة في حين خلط كل ثلاث دقائق عن طريق عكس. بعد هذا، الطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق.
يجب أن تكون بيليه الجهازية واضحة في حين أن طبقة BME يجب أن تختفي. إذا انخفضت طبقة BME في الحجم ولكنها لا تزال مرئية، احتضان لمدة 30 دقيقة إضافية في أربع درجات مئوية وتكرار الطرد المركزي. مرة واحدة وقد تم depolymerized BME، وإزالة حل استرداد الخلية في حين ترك وراءه بيليه organoid.
غسل organoids مع 10 ملليلتر من وسائل الإعلام القاعدية عن طريق الاختلاط مع انقلاب. الطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق، وإزالة ناظر، ووضع أنبوب مع بيليه organoid على الجليد لمدة خمس دقائق على الأقل. اختياريا، إذا كان المطلوب إعداد خلية واحدة، إضافة ثلاثة ملليلتر من التربسين تكملها 30 ميكرولترات من DNAse الأول الحل إلى organoids.
احتضان هذا التفاعل الأنزيمي في 37 درجة مئوية مع انعكاس لطيف خلط كل دقيقتين لمدة تصل إلى 10 دقائق. استخدام المجهر برايتفيلد لمراقبة وتأكيد أن تفكك خلية واحدة ناجحة. لوقف التفاعل الأنزيمي، إضافة 10 ملليلتر من الجليد الباردة وسائط القاعدية وتدور في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق.
ثم إزالة ناظر. اغسل الخلايا بـ 10 ملليلترات من الوسائط القاعدية عن طريق الاختلاط مع الانعكاس اللطيف. مرة أخرى في جهاز طرد مركزي 200 مرة ز لمدة خمس دقائق.
إزالة فائقة وتكرار هذه عملية غسل وrifuging مرة أخرى. ضع الأنبوب مع بيليه الخلية على الجليد لمدة خمس دقائق على الأقل. بعد ذلك، إضافة الجليد البارد BME إلى بيليه الخلية واستخدام ماصة P200 لخلط الحل بلطف حتى يكون متجانسا.
ثم ضع طرف الماصة بالقرب من الجزء السفلي من الأنبوب والماصة صعودا وهبوطا ما لا يقل عن خمس إلى 10 مرات لتفريق ميكانيكيا organoids. استخدام ماصة P200 لبقعة قبة 100 ميكرولتر في وسط بئر من قبل تسخين 12 جيدا لوحة. كرر حتى يتم الاستغناء عن كل من حل BME.
ثم نقل بعناية لوحة إلى حاضنة في 37 درجة مئوية للسماح هلام BME لترسيخ. بعد 10 دقائق، واسترداد لوحة وإضافة ملليلتر واحد من وسائل الإعلام العضوية كاملة قبل الدافئة إلى كل بئر. وعادة ما يتم تمرير الثقافات العضوية على مدى سبعة إلى 10 أيام اعتمادا على كثافة الثقافة والانتشار.
إذا لزم الأمر، قم بزيادة الثقافات مع 200 ميكرولترات من وسائل الإعلام العضوية الدافئة مسبقاً كل خمسة أيام للتعويض عن استنفاد عامل النمو والتبخر. بعد عزل الخلايا الفردية من الأعضاء ، resuspend الخلايا المفردة في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام الكاملة العضوية البشرية. بعد ذلك، استخدم عداد خلية تلقائية لحساب الخلايا مع التأكد من تسجيل صلاحية الخلية.
حساب العدد الإجمالي للخلايا والخلايا القابلة للحياة الموجودة في تعليق ميليلتر واحد. ثم إزالة حجم يعادل 400،000 الخلايا ونقلها إلى أنبوب جديد. إضافة وسائل الاعلام العضوية كاملة لهذا الأنبوب لتحقيق حجم يصل إلى 7.2 ملليلتر.
للاختبار العلاجي، قم بإعداد الخلايا للطلاء عن طريق خلط 800 ميكرولتر من BME مع 7.2 ملليلتر من الوسائط الكاملة العضوية التي تحتوي على الخلايا على الجليد. نقل الخليط إلى خزان الاحتفاظ على الجليد واستخدام ماصة 12 قناة لصفيح 20 ميكرولترات من هذا الخليط في كل بئر من لوحة 384 جيدا مما أدى إلى ما يقرب من 1،000 الخلايا يجري مطلية في بئر. ثم تدور أسفل لوحة في 100 مرة ز لمدة دقيقة واحدة في دلو أرجوحة ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الأنسجة في 37 درجة مئوية.
بعد 24 ساعة، استخدم مجهر برايتفيلد للتحقق من وجود الأجهزة. في هذه الدراسة ، يتم عزل الجهاز العضوي PDAC المشتق من المريض وتوسيعه وتميزه. لتوضيح التحديات المرتبطة بعزل الأعضاء من PDAC ، يتم تأسيس ثقافة أعضاءية تمثيلية مشتقة من المريض من عينة ورم ناقص الخلية صغيرة.
ويسمح organoids أن تنمو أكبر على مدى أسبوعين ويتم تمريرها وفقا للبروتوكول لإنشاء ثقافة أكثر قوة. خلايا واحدة من المنشأة وسريعة النمو ممثل PDAC organoid ثم يتم إعدادها لإثبات نتيجة بروتوكول pharmacotyping. 1,000 يتم مطلي الخلايا القابلة للحياة في كل بئر ويسمح للتعافي على مدى فترة 24 ساعة قبل أن يتم حقن وكلاء العلاج الكيميائي السام للخلايا.
يتم إجراء فحص الجرعة 9.0 في ثلاثية كريات بدءا من جرعة منخفضة من 100 picomolar وتنتهي مع جرعة عالية من اثنين من micromolar. بعد العلاج لمدة خمسة أيام، يتم التقاط صور تمثيلية للآبار المعالجة بالمركبة وبجرعة عالية من كل عامل كيميائي. مباشرة بعد التقاط الصور، يتم تقييم صلاحية الخلية باستخدام كاشف قابلية الخلية للإنارة وتآمر باستخدام برنامج الرسوم البيانية.
يمكن أن يكون الأعضاء المشتقة من المريض لديها مورفولولوجيا غير متجانسة. لذلك، من المهم تحسين حالات الانفصال الأنزيمية لكل ثقافة واحدة. عادةً ما ينطوي تحليل الزّقوط للنماذج المشتقة من المريض على تسلسل الجيل التالي من الحمض النووي والحمض النووي الريبي.
إذا كان ذلك ممكنا، والتحقق من صحة الخصائص الجزيئية للنماذج باستخدام عينات الأنسجة الأولية. الثقافات العضوية الفردية تفتح إمكانية للنهج الطب الشخصية لمرضى سرطان البنكرياس. تذكر أن المواد الكيميائية الخطرة مثل الفينول الكلوروفورم والعوامل الكيميائية يجب التعامل معها مع معدات الحماية الشخصية المناسبة والسلامة.
