환자 유래 오르가노이드 모델은 이 질병의 유전적 및 현상이 있는 이질성을 반영하기 때문에 췌장암을 연구할 수 있는 강력하고 신속한 도구이기 때문에 이 방법이 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 오르가노이드가 제한된 양의 암에서 높은 성공률로 격리 될 수 있으며 다운스트림 분석을위한 시험관 에서 빠르게 확장 될 수 있다는 것입니다. 세포 독성 약물에 대한 오르가노이드의 반응을 연구하면 종양이 치료에 내성이 되는 이유를 이해하고 보다 효과적인 치료 전략을 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 절차를 시작하려면 인큐베이터에서 준비된 12웰 플레이트를 회수합니다. 멸균 셀 리프터를 사용하면 지하 멤브레인 추출물 돔을 부드럽게 들어 올려 우물 바닥을 긁지 않도록하면서 전체 매체에 떠 있습니다. P1000 파이펫을 사용하여 BME 돔과 미디어를 15밀리리터 원피스 튜브로 조심스럽게 이송합니다.
모든 오르가노이드 함유에 대해이 단계를 잘 반복하십시오. 차가운 기저 질의 1 밀리리터로 수확된 각 우물을 부드럽게 씻고 이 세척을 오르가노이드가 함유된 튜브로 옮춥춥시다. 용액과 오르가노이드를 P1000 파이펫과 철저히 혼합하고 5분 동안 200배 g로 회전합니다.
현탁액및 오르가노이드 펠릿에 오르가노이드를 함유하는 BME층이 튜브 의 바닥에 나타납니다. BME 및 오르가노이드 층의 손실을 피하기 위해 상체를 조심스럽게 제거하십시오. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
튜브에 얼음 차가운 세포 복구 용액 10 밀리리터를 추가하고 반전으로 철저히 섞습니다. 반전으로 3분간격으로 섞으면서 30분 간 얼음에 배양합니다. 그 후 원심분리기는 5분간 200배 g로 합니다.
BME 층이 사라져야하는 동안 오르가노이드 펠릿은 명백해야합니다. BME 층의 크기가 감소하지만 여전히 보이는 경우 섭씨 4도에서 추가로 30 분 동안 배양하고 원심 분리를 반복하십시오. BME가 폴리머화되면, 오르가노이드 펠릿을 남기면서 세포 회수 용액을 제거한다.
오르가노이드를 10 밀리리터의 기초 매체로 씻어 반전과 혼합하여 씻으세요. 원심분리기는 5분 동안 200배 g로, 상류체를 제거하고, 적어도 5분 동안 얼음 위에 오르가노이드 펠릿을 장착한 튜브를 놓습니다. 선택적으로, 단일 세포 준비를 원하는 경우에, 오르가노이드에 DNAse I 용액의 30 마이크로 리터로 보충 트립신의 3 밀리리터를 추가합니다.
37도에서 이 효소 반응을 최대 10분 동안 2분간격으로 부드럽게 반전할 수 있습니다. 브라이트필드 현미경을 사용하여 단일 세포 해리가 성공적임을 모니터링하고 확인합니다. 효소 반응을 막으려면 얼음 차가운 기저 미디어의 10 밀리리터를 추가하고 5 분 동안 200 배 g에서 회전하십시오.
그런 다음 상체를 제거합니다. 부드러운 반전과 혼합하여 기저 미디어의 10 밀리리터로 세포를 씻어. 원심 분리기는 5 분 동안 200 배 g에서 다시 합니다.
상체를 제거하고이 세척 및 원심 분리 과정을 다시 한 번 반복합니다. 적어도 5 분 동안 얼음에 세포 펠릿튜브를 놓습니다. 그런 다음, 세포 펠릿에 얼음 차가운 BME를 추가하고 P200 파이펫을 사용하여 균일할 때까지 용액을 부드럽게 혼합합니다.
그런 다음 파이펫 끝을 튜브 의 바닥에 가깝게 놓고 파이펫을 적어도 5~10회 위아래로 올려 놓고 기계적으로 오르가노이드를 분해합니다. P200 파이펫을 사용하여 미리 데워진 12웰 플레이트의 중앙에 있는 100 마이크로리터 돔을 발견하십시오. 모든 BME 솔루션이 분배될 때까지 반복합니다.
그런 다음 조심스럽게 BME 젤이 고화 할 수 있도록 섭씨 37도에서 인큐베이터로 플레이트를 전송합니다. 10분 후, 접시를 회수하고 미리 데워진 오르가노이드 완성 용지 1밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 오르가노이드 배양은 일반적으로 배양 밀도 및 증식에 따라 7~10일 이상 통과됩니다.
필요한 경우, 성장 인자 고갈 및 증발을 보상하기 위해 5 일마다 사전 따뜻하게 된 오르가노이드 완성 매체의 200 마이크로 리터로 문화를 보충하십시오. 오르가노이드에서 단일 세포를 격리 한 후, 인간 오르가노이드 완성 매체의 1 밀리리터에서 단일 세포를 다시 중단합니다. 다음으로, 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 생존 가능성을 기록하는 셀을 계산합니다.
1 밀리리터 서스펜션에 존재하는 총 세포 수와 실행 가능한 세포를 계산합니다. 그런 다음 400, 000 셀에 해당하는 부피를 제거하고 새로운 튜브로 옮김합니다. 이 튜브에 오르가노이드 완전 미디어를 추가하여 최대 7.2 밀리리터의 볼륨을 가져옵니다.
치료 테스트를 위해, 얼음에 세포를 포함하는 오르가노이드 완전 매체의 7.2 밀리리터와 BME의 800 마이크로리터를 혼합하여 도금세포를 준비합니다. 혼합물을 얼음 위에 보관하는 저수지로 옮기고 12채널 파이펫을 사용하여 이 혼합물의 20 마이크로리터를 384웰 플레이트의 각 웰로 플레이트하여 웰당 약 1, 000개의 세포가 도금된다. 그런 다음 그네 버킷에서 1 분 동안 100 배 g에서 접시를 회전시키고 접시를 섭씨 37도에서 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다.
24 시간 후에, 오르가노이드의 존재를 확인하기 위하여 브라이트 필드 현미경을 이용합니다. 이 연구에서는, 환자 유래 PDAC 오르간노이드는 고립되고, 확장되고, 특징지입니다. PDAC에서 유기노이드를 분리하는 것과 관련된 과제를 설명하기 위해, 대표적인 환자 유래 오르가노이드 배양은 작은 저세포 종양 샘플에서 확립된다.
오르가노이드는 2 주 동안 더 크게 성장할 수 있으며 프로토콜에 따라 통과되어 보다 강력한 문화를 확립합니다. 확립되고 빠르게 성장하는 대표 PDAC 오르간노이드의 단일 세포는 약전 프로토콜의 결과를 입증할 준비가 되어 있습니다. 1, 000의 실행 가능한 세포는 각 우물에서 도금되고 세포 독성 화학 요법 에이전트가 투약되기 전에 24 시간 기간 동안 회복할 수 있습니다.
A 9.0 용량 분석의 낮은 복용량으로 시작 하 여 triplicate에서 수행 100 피코몰러 와 두 개의 마이크로 몰러의 높은 복용량으로 끝나는. 5 일 치료 후, 대표 사진은 차량과 각 화학 요법 에이전트의 높은 용량으로 치료 우물에 대한 촬영됩니다. 사진을 찍은 직후, 세포 생존가능성은 발광 세포 생존 능력 시약을 사용하여 평가되고 그래프 소프트웨어를 사용하여 플롯됩니다.
환자 유래 오르가노이드는 이질적인 형태를 가질 수 있습니다. 따라서 모든 단일 문화에 대한 효소 적 해리를 최적화하는 것이 중요합니다. 환자 유래 모델의 다운스트림 분석은 일반적으로 DNA와 RNA의 차세대 염기서열분석을 수반한다.
가능하면 1차 조직 샘플을 사용하여 모델의 분자 특성을 검증합니다. 개별화된 오르가노이드 배양은 췌장암 환자를 위한 개인화된 약 접근을 위한 가능성을 열어주습니다. 페놀 클로로폼 및 화학요법 제과 같은 유해 화학 물질은 적절한 PPE 및 안전 장비로 처리되어야 합니다.
