患者由来のオルガノイドモデルは、この疾患の遺伝的および表現型異質性を反映した膵臓癌を研究するための強力かつ迅速なツールであるため、この方法は重要である。この技術の主な利点は、オルガノイドは限られた量の癌から高い成功率で単離することができ、下流の分析のためにインビトロで急速に拡大することができるということです。細胞毒性薬に対するオルガノイドの反応を研究することは、腫瘍が治療に耐性になる理由を理解し、より効果的な治療戦略を定義するのに役立つかもしれません。
この手順を開始するには、調製した12ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。無菌セルリフターを使用して、底面を削らないようにしながら、完全な媒体に浮遊するように、地下膜エキスドームをそっと持ち上げます。P1000ピペットを使用して、BMEドームとメディアを慎重に15ミリリットルの円錐チューブに移します。
オルガノイド含有ウェルごとにこのステップを繰り返します。1ミリリットルの冷たい基底培地で収穫したウェルをそっと洗い、オルガノイドを含むチューブに移します。溶液とオルガノイドをP1000ピペットで十分に混合し、200倍gで5分間スピンダウンします。
懸濁液中のオルガノイドとオルガノイドペレットを含むBMEの層がチューブの下部に現れます。上清を慎重に除去し、BMEとオルガノイド層の損失を避けてください。チューブを氷の上に置きます。
チューブに氷冷細胞回収液の10ミリリットルを追加し、完全に反転によって混合.反転によって3分ごとに混合しながら、氷の上で30分間インキュベートします。この後、200回gで5分間遠心分離する。
BME層がなくなっている間、オルガノイドペレットは明らかであるべきです。BME層のサイズは小さくても目に見える場合は、摂氏4度でさらに30分間インキュベートし、遠心分離を繰り返します。BMEを脱重化したら、オルガノイドペレットを残したまま細胞回収液を除去する。
オルガノイドを10ミリリットルの基底培地で洗浄し、反転と混合します。200回gで5分間遠心分離機を取り出し、オルガノイドペレットを氷の上に5分間置きます。必要に応じて、単一の細胞製剤が望ましい場合、30マイクロリットルのDNAse I溶液を添加したトリプシンをオルガノイドに加える。
この酵素反応を摂氏37度でインキュベートし、2分ごとに最大10分間穏やかな反転を混合します。ブライトフィールド顕微鏡を使用して、単一細胞の解離が成功したことを監視し、確認します。酵素反応を止めるには、氷冷基底培地を10ミリリットル加え、200倍gで5分間スピンダウンします。
その後、上清を取り除く。穏やかな反転と混合することにより、基底培地の10ミリリットルで細胞を洗浄します。5分間200回gで再び遠心分離機。
上清を取り除き、この洗浄と遠心分離プロセスをもう一度繰り返します。細胞ペレットを入れたチューブを氷の上に少なくとも5分間置きます。この後、細胞ペレットに氷冷BMEを加え、P200ピペットを使用して均質になるまで溶液を穏やかに混ぜます。
その後、管の底に近いピペットの先端を置き、ピペットを少なくとも5〜10回上下に置き、オルガノイドを機械的に分解します。P200ピペットを使用して、事前に温めた12ウェルプレートの井戸の中央に100マイクロリットルのドームを見つけます。すべてのBMEソリューションが分配されるまで繰り返します。
その後、慎重にBMEゲルを固めるために摂氏37度のインキュベーターにプレートを移します。10分後、プレートを取り出し、各ウェルに予温されたオルガノイド完全な培地を1ミリリットル加えます。オルガノイド培養は、典型的には、培養密度および増殖に応じて7〜10日にわたって通過する。
必要に応じて、成長因子の枯渇と蒸発を補うために、5日ごとに200マイクロリットルの予熱されたオルガノイド完全な培地で培養をトップアップします。オルガノイドから単一細胞を単離した後、ヒトオルガノイド完全培地の1ミリリットルで単一細胞を再懸濁させる。次に、自動セル カウンタを使用してセルの生存率を記録するようにセルをカウントします。
1ミリリットルの懸濁液に存在する細胞および生存細胞の総数を計算する。その後、400,000個の細胞に相当する体積を取り除き、新しいチューブに移します。このチューブにオルガノイドの完全な培地を加え、体積を7.2ミリリットルまで引き上げる。
治療試験のために、800マイクロリットルのBMEと7.2ミリリットルのオルガノイド完全培地を氷上に含む完全な培地と混合して、めっき用の細胞を調製する。氷の上に保管されている貯水池に混合物を移し、12チャネルのピペットを使用して、この混合物の20マイクロリットルを384ウェルプレートの各ウェルにプレートし、約1,000個の細胞がウェルごとにメッキされます。その後、スイングバケツで100倍gでプレートを回転させ、プレートを摂氏37度の組織培養インキュベーターに入れる。
24時間後、ブライトフィールド顕微鏡を使用してオルガノイドの存在を確認します。本研究では、患者由来のPDACオルガノイドが単離され、拡張され、特徴付けられる。PDACからのオルガノイドの単離に関連する課題を説明するために、代表的な患者由来のオルガノイド培養は、小さな低細胞腫瘍サンプルから確立される。
オルガノイドは、2週間にわたって大きく成長することが許され、より堅牢な文化を確立するためのプロトコルに従って通過される。確立され、急速に成長している代表的なPDACオルガノイドからの単一細胞は、次に、薬物型変換プロトコルの結果を実証するために準備される。1,000個の生存細胞は、各ウェルでめっきされ、細胞傷害性化学療法剤が投薬される前に24時間にわたって回復することを許される。
9.0用量アッセイは、100ピコモラーの低用量で始まり、2つのマイクロモルの高用量で終わる三重で行われる。5日間の治療の後、代表的な写真は、車両で治療された井戸と各化学療法剤の高用量で撮影される。写真を撮った直後に、細胞生存率を発光細胞生存率試薬を用いて評価し、グラフ化ソフトウェアを用いてプロットする。
患者由来のオルガノイドは、異種形態を有することができる。したがって、すべての単一のカルチャに対して酵素的解離を最適化することが重要です。患者由来モデルの下流解析は、通常、DNAおよびRNAの次世代シーケンシングを伴う。
可能であれば、一次組織サンプルを用いてモデルの分子特性を検証する。個別化されたオルガノイド培養は、膵臓癌患者のための個別化医療アプローチの可能性を開きます。フェノールクロロホルムや化学療法剤などの有害化学物質は、適切なPPEおよび安全装置で取り扱う必要があることを覚えておいてください。
