Этот метод имеет важное значение, поскольку полученные пациентом органоидные модели являются мощным и быстрым инструментом для изучения рака поджелудочной железы, поскольку они отражают генетическую и фенотипичную неоднородность этого заболевания. Основным преимуществом этого метода является то, что органоиды могут быть изолированы с высоким уровнем успеха от ограниченного количества рака, и они могут быть быстро расширены в пробирке для анализа вниз по течению. Изучение реакции органоидов на цитотоксические препараты может помочь нам понять, почему опухоли становятся устойчивыми к терапии, и определить более эффективные стратегии лечения.
Чтобы начать эту процедуру, получить подготовленные 12-хорошо пластины из инкубатора. С стерильным подъемником клетки, нежно поднимите купол экстракта мембраны подвала таким образом что он плавает в вполне средствах пока убеждаясь во избежание выскабливание дна наилучшим образом. Используя пипетку P1000, тщательно перенесите купол BME и средства массовой информации в 15-миллилитровую коническую трубку.
Повторите этот шаг для каждого органоидно-содержащего хорошо. Аккуратно мыть каждый колодец, который был собран с одним миллилитр холодных базальных средств массовой информации и передать эту стирку в трубку, содержащую органоиды. Тщательно смешать раствор и органоиды с P1000 пипетки и спина вниз на 200 раз г в течение пяти минут.
Слой BME, содержащий органоиды в суспензии и органоидные гранулы появится в нижней части трубки. Тщательно удалите супернатант, чтобы избежать потери BME и органоидного слоя. Поместите трубку на лед.
Добавьте 10 миллилитров раствора восстановления холодных клеток льда в трубку и тщательно перемешайте с помощью инверсии. Инкубировать на льду в течение 30 минут, смешивая каждые три минуты инверсии. После этого центрифугу 200 раз г в течение пяти минут.
Органоидные гранулы должны быть очевидными в то время как слой BME должен исчезнуть. Если слой BME уменьшен в размерах, но все еще виден, инкубировать в течение еще 30 минут при четырех градусах по Цельсию и повторить центрифугации. После того, как BME был деполимеризирован, удалить раствор восстановления клеток, оставляя после себя органоидные гранулы.
Вымойте органоиды с 10 миллилитров базальных средств массовой информации путем смешивания с инверсией. Центрифуга в 200 раз г в течение пяти минут, удалить супернатант, и поместите трубку с органоидной гранулы на лед, по крайней мере пять минут. Дополнительно, если один клеточный препарат желателен, добавьте три миллилитров трипсина, дополненных 30 микролитров раствора DNAse I к органоидам.
Инкубировать эту энзиматической реакции при 37 градусов по Цельсию с нежной инверсии смешивания каждые две минуты до 10 минут. Используйте микроскоп Brightfield для мониторинга и подтверждения того, что одноклеточная диссоциация успешна. Чтобы остановить энзиматические реакции, добавьте 10 миллилитров холодных базальных средств массовой информации и вращайте вниз при 200 раз г в течение пяти минут.
Затем удалите супернатант. Вымойте клетки с 10 миллилитров базальных средств массовой информации путем смешивания с нежной инверсии. Центрифуга снова в 200 раз г в течение пяти минут.
Удалите супернатант и повторите этот процесс мытья и центрифугирования еще раз. Поместите трубку с клеточной гранулы на лед, по крайней мере пять минут. После этого добавьте ледяной BME в гранулы клетки и используйте P200 пипетки, чтобы смешать раствор осторожно, пока он не однороден.
Затем поместите кончик пипетки близко к нижней части трубки и пипетки вверх и вниз, по крайней мере пять-десять раз, чтобы механически разбить органоиды. Используйте пипетки P200, чтобы обнаружить 100 микролитровый купол в центре колодец предварительно разогретой 12-хорошо пластины. Повторяйте до тех пор, пока все решения BME не будут освобождены.
Затем осторожно перенесите пластину в инкубатор при 37 градусах цельсия, чтобы гель BME затвердеет. Через 10 минут, получить пластину и добавить один миллилитр предварительно разогретых органоидных полных средств массовой информации для каждого хорошо. Органоидные культуры, как правило, проносяты в течение семи-10 дней в зависимости от плотности культуры и распространения.
При необходимости, пополнить культуры с 200 микролитров предварительно разогретых органоидных полных средств массовой информации каждые пять дней, чтобы компенсировать истощение фактора роста и испарения. После изоляции одиночных клеток от органоидов, повторное выделение одной клетки в один миллилитр человеческого органоида полных средств массовой информации. Далее используйте автоматизированный счетчик ячеек для подсчета ячеек, чтобы убедиться в жизнеспособности ячейки.
Рассчитайте общее количество ячеек и жизнеспособных ячеек, присутствующих в одноми миллилитровой подвеске. Затем удалите объем, эквивалентный 400 000 ячеек, и перенесите его в новую трубку. Добавьте органоидные полные средства массовой информации в эту трубку, чтобы довести громкость до 7,2 миллилитров.
Для терапевтического тестирования, подготовить клетки для покрытия путем смешивания 800 микролитров BME с 7,2 миллилитров органоидных полных средств массовой информации, содержащих клетки на льду. Перенесите смесь в резервуар, который хранится на льду, и используйте 12-канальную пипетку для пластины 20 микролитров этой смеси в каждую колодец 384-хорошо пластины, в результате чего примерно 1000 клеток помойка на колодец. Затем спина вниз пластины в 100 раз г в течение одной минуты в ведро качели и поместить пластину в инкубатор культуры тканей при 37 градусов по Цельсию.
Через 24 часа используйте микроскоп Брайтфилда, чтобы проверить наличие органоидов. В этом исследовании органоид PDAC, полученный пациентом, изолирован, расширен и охарактеризован. Чтобы проиллюстрировать проблемы, связанные с изоляцией органоидов от PDAC, репрезентативная органоидная культура, полученная пациентом, устанавливается из небольшого гипоклеточного образца опухоли.
Органоиды могут расти больше в течение двух недель и проносясь в соответствии с протоколом, чтобы установить более надежную культуру. Одиночные клетки от установленного и быстро растущего представителя органоид PDAC после этого подготовлены для того чтобы продемонстрировать исход протокола фармакотипинга. 1000 жизнеспособных клеток помылись в каждой хорошо и позволили восстановить в течение 24-часового периода до цитотоксических химиотерапевтических агентов досасы.
Анализ дозы 9.0 выполняется в тройном, начиная с низкой дозы 100 пикомолярных и заканчивая высокой дозой двух микромолеров. После пятидневного лечения, репрезентативные фотографии принимаются для скважин, обработанных транспортным средством и с высокой дозой каждого химиотерапевтического агента. Сразу же после съемки, жизнеспособность клеток оценивается с помощью реагентов люминесцентных клеток и построена с помощью программного обеспечения для графики.
Органоиды, полученные пациентом, могут иметь неоднородные морфологии. Поэтому важно оптимизировать энзиматические диссоциации для каждой культуры. Вниз по течению анализ моделей, полученных пациентом, обычно включает в себя секвенирование ДНК и РНК следующего поколения.
По возможности проверяйте молекулярные характеристики моделей с использованием образцов первичных тканей. Индивидуальные органоидные культуры открывают возможности для персонализированных подходов медицины для больных раком поджелудочной железы. Помните, что опасные химические вещества, такие как фенол-хлороформ и химиотерапевтические агенты должны быть обработаны с соответствующими СИЗ и безопасности оборудования.
