Este método es significativo porque los modelos organoides derivados del paciente son una herramienta potente y rápida para estudiar el cáncer de páncreas, ya que reflejan la heterogeneidad genética y fenotípica de esta enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que los organoides se pueden aislar con una alta tasa de éxito de una cantidad limitada de cáncer y se pueden expandir rápidamente in vitro para el análisis posterior. El estudio de la respuesta de los organoides a los medicamentos citotóxicos puede ayudarnos a entender por qué los tumores se vuelven resistentes a la terapia y a definir estrategias de tratamiento más eficaces.
Para comenzar este procedimiento, recupere la placa de 12 pozos preparada de la incubadora. Con un elevador de células estériles, levante suavemente la cúpula de extracto de membrana del sótano de manera que esté flotando en los medios completos mientras se asegura de evitar raspar la parte inferior del pozo. Con una pipeta P1000, transfiera cuidadosamente la cúpula BME y los medios a un tubo cónico de 15 mililitros.
Repita este paso para cada pozo que contenga organoides. Lave suavemente cada pozo que se haya cosechado con un mililitro de medios basales fríos y transfiera este lavado al tubo que contiene los organoides. Mezclar a fondo la solución y los organoides con una pipeta P1000 y girar hacia abajo a 200 veces g durante cinco minutos.
Una capa de BME que contiene organoides en suspensión y un pellet organoides aparecerá en la parte inferior del tubo. Retire cuidadosamente el sobrenadante asegurándose de evitar cualquier pérdida de la capa BME y organoidea. Coloque el tubo sobre hielo.
Agregue 10 mililitros de solución de recuperación de células heladas al tubo y mezcle a fondo por inversión. Incubar sobre hielo durante 30 minutos mientras se mezcla cada tres minutos por inversión. Después de esto, centrifugar a 200 veces g durante cinco minutos.
El pellet organoide debe ser evidente mientras que la capa BME debe desaparecer. Si la capa BME se reduce de tamaño pero sigue siendo visible, incubar durante 30 minutos adicionales a cuatro grados centígrados y repetir la centrifugación. Una vez que el BME ha sido despolimerizado, retire la solución de recuperación celular dejando atrás el pellet organoide.
Lavar los organoides con 10 mililitros de medios basales mezclando con la inversión. Centrifugar a 200 veces g durante cinco minutos, retire el sobrenadante y coloque el tubo con el pellet organoide sobre hielo durante al menos cinco minutos. Opcionalmente, si se desea una sola preparación celular, añadir tres mililitros de trippsina complementados con 30 microlitros de DNAse I solución a los organoides.
Incubar esta reacción enzimática a 37 grados centígrados con una suave mezcla de inversión cada dos minutos durante un máximo de 10 minutos. Utilice un microscopio Brightfield para monitorear y confirmar que la disociación de una sola célula es exitosa. Para detener la reacción enzimática, agregue 10 mililitros de medios basales fríos y gire hacia abajo a 200 veces g durante cinco minutos.
A continuación, retire el sobrenadante. Lavar las células con 10 mililitros de medios basales mezclando con una inversión suave. Centrifugar de nuevo a 200 veces g durante cinco minutos.
Retire el sobrenadante y repita este proceso de lavado y centrifugación una vez más. Coloque el tubo con el pellet celular sobre hielo durante al menos cinco minutos. Después de esto, añadir BME helado al pellet celular y utilizar una pipeta P200 para mezclar la solución suavemente hasta que sea homogénea.
A continuación, coloque la punta de la pipeta cerca de la parte inferior del tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo al menos cinco a 10 veces para romper mecánicamente los organoides. Utilice una pipeta P200 para detectar una cúpula de 100 microlitros en el centro de un pozo de una placa precale calentada de 12 pozos. Repita el proceso hasta que se prescinda toda la solución BME.
A continuación, transfiera cuidadosamente la placa a una incubadora a 37 grados Centígrados para permitir que el gel BME se solidifique. Después de 10 minutos, recupere la placa y agregue un mililitro de organoide precalentó a cada pozo. Los cultivos organoides se pasan típicamente durante siete a 10 días dependiendo de la densidad de cultivo y la proliferación.
Si es necesario, recuple los cultivos con 200 microlitros de medios completos organoides precalegados cada cinco días para compensar el agotamiento y la evaporación del factor de crecimiento. Después de aislar las células individuales de los organoides, resuspendir las células individuales en un mililitro de medios completos organoides humanos. A continuación, utilice un contador de celdas automatizado para contar las celdas asegurándose de registrar la viabilidad de la celda.
Calcular el número total de células y células viables presentes en la suspensión de un mililitro. Luego retire el volumen equivalente a 400.000 células y transfiételo a un tubo nuevo. Agregue medios completos organoides a este tubo para subir el volumen hasta 7,2 mililitros.
Para pruebas terapéuticas, prepare las células para el enchapado mezclando 800 microlitros de BME con 7,2 mililitros de medios completos organoides que contienen las células sobre hielo. Transfiera la mezcla a un depósito mantenido sobre hielo y utilice una pipeta de 12 canales para placar 20 microlitros de esta mezcla en cada pozo de una placa de 384 pozos, lo que da como resultado aproximadamente 1.000 células que se vajillan por pozo. A continuación, gire hacia abajo la placa a 100 veces g durante un minuto en un cubo oscilante y coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejido a 37 grados centígrados.
Después de 24 horas, utilice un microscopio Brightfield para comprobar la presencia de organoides. En este estudio, los organoides PDAC derivados del paciente se aíslan, expanden y caracterizan. Para ilustrar los desafíos asociados con el aislamiento de organoides de PDAC, se establece un cultivo organoide representativo derivado del paciente a partir de una pequeña muestra de tumor hipocelular.
Se permite que los organoides crezcan más en el lapso de dos semanas y se pasan de acuerdo con el protocolo para establecer un cultivo más robusto. Las células individuales de un organoide PDAC representativo establecido y de rápido crecimiento se preparan para demostrar el resultado del protocolo de farmacotipado. 1.000 células viables se vajilla en cada pozo y se les permite recuperarse durante un período de 24 horas antes de que se dosifican los agentes quimioterapéuticos citotóxicos.
Se realiza un ensayo de dosis de 9,0 en triplicado, comenzando con una dosis baja de 100 picomolares y terminando con una dosis alta de dos micromolares. Después de un tratamiento de cinco días, se toman fotografías representativas para los pozos tratados con el vehículo y con la dosis alta de cada agente quimioteráptico. Inmediatamente después de tomar las fotografías, la viabilidad celular se evalúa utilizando reactivo de viabilidad celular luminiscente y se traza utilizando software de gráficos.
Los organoides derivados del paciente pueden tener morfologías heterogéneas. Por lo tanto, es importante optimizar las disociaciones enzimáticas para cada cultura. El análisis posterior de los modelos derivados del paciente generalmente implica la secuenciación de próxima generación del ADN y el ARN.
Si es posible, valide las características moleculares de los modelos utilizando muestras de tejido primario. Los cultivos organoides individualizados abren la posibilidad de enfoques de medicina personalizada para pacientes con cáncer de páncreas. Recuerde que los productos químicos peligrosos, como el fenol-cloroformo y los agentes quimioterápticos, deben manipularse con epidémica y equipo de seguridad adecuados.
