Diese Methode ist wichtig, da vom Patienten abgeleitete Organoidmodelle ein leistungsfähiges und schnelles Werkzeug sind, um Bauchspeicheldrüsenkrebs zu untersuchen, da sie die genetische und phänotypische Heterogenität dieser Krankheit widerspiegeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Organoide mit einer hohen Erfolgsrate von einer begrenzten Krebsmenge isoliert und für die nachgelagerte Analyse schnell in vitro erweitert werden können. Das Studium der Reaktion von Organoiden auf zytotoxische Medikamente kann uns helfen zu verstehen, warum Tumore resistent gegen Therapie werden und effektivere Behandlungsstrategien definieren.
Um dieses Verfahren zu beginnen, rufen Sie die vorbereitete 12-Well-Platte aus dem Inkubator ab. Mit einem sterilen Zellheber, heben Sie vorsichtig die Keller Membran-Extrakt-Kuppel so, dass es in der gesamten Medien schwebt, während sie sicherstellen, dass nicht kratzen den Boden des Brunnens. Mit einer P1000 Pipette übertragen Sie die BME-Kuppel und die Medien vorsichtig auf ein 15 Milliliter Konikonrohr.
Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden organoidhaltigen Brunnen. Waschen Sie jeden Brunnen, der mit einem Milliliter kalter Basalmedien geerntet wurde, sanft und übertragen Sie ihn auf das Rohr mit den Organoiden. Die Lösung und die Organoide mit einer P1000 Pipette gründlich mischen und fünf Minuten lang bei 200 mal g nach unten drehen.
Eine Schicht von BME, die Organoide in Suspension und ein Organoidpellet enthält, erscheint an der Unterseite des Rohres. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und stellen Sie sicher, dass ein Verlust der BME- und Organoidschicht vermieden wird. Legen Sie die Röhre auf Eis.
Fügen Sie 10 Milliliter eiskalte Zell-Recovery-Lösung in die Röhre und gründlich durch Inversion mischen. Auf Eis für 30 Minuten inkubieren, während alle drei Minuten durch Inversion gemischt. Danach zentrifugieren Sie bei 200 mal g für fünf Minuten.
Das Organoidpellet sollte sichtbar sein, während die BME-Schicht weg sein sollte. Wenn die BME-Schicht verkleinert, aber immer noch sichtbar ist, weitere 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren und die Zentrifugation wiederholen. Sobald das BME depolymerisiert wurde, entfernen Sie die Zellrückgewinnungslösung, während Sie das Organoidpellet zurücklassen.
Waschen Sie die Organoide mit 10 Milliliter n.A. Basalmedien, indem Sie sie mit Inversion mischen. Zentrifugieren Sie bei 200 mal g für fünf Minuten, entfernen Sie den Überstand, und legen Sie das Rohr mit dem Organoidpellet auf Eis für mindestens fünf Minuten. Optional, wenn eine einzelzellige Zubereitung gewünscht wird, fügen Sie drei Milliliter Trypsin mit 30 Mikroliter DNAse I Lösung zu den Organoiden ergänzt.
Inkubieren Sie diese enzymatische Reaktion bei 37 Grad Celsius mit sanfter Inversion, die alle zwei Minuten für bis zu 10 Minuten gemischt wird. Verwenden Sie ein Brightfield-Mikroskop, um zu überwachen und zu bestätigen, dass die Einzelzelldissoziation erfolgreich ist. Um die enzymatische Reaktion zu stoppen, fügen Sie 10 Milliliter eiskalte Basalmedien hinzu und drehen Sie sich fünf Minuten lang bei 200 mal g.
Entfernen Sie dann den Überstand. Waschen Sie die Zellen mit 10 Milliliter n.A. Basalmedien, indem Sie sie mit sanfter Inversion mischen. Zentrifugieren Sie wieder bei 200 mal g für fünf Minuten.
Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie diesen Wasch- und Zentrifugierungsprozess noch einmal. Legen Sie das Rohr mit dem Zellpellet mindestens fünf Minuten auf Eis. Danach eiskaltes BME in das Zellpellet geben und eine P200 Pipette verwenden, um die Lösung sanft zu mischen, bis sie homogen ist.
Dann legen Sie die Spitze der Pipette in der Nähe der Unterseite des Rohres und Pipette nach oben und unten mindestens fünf bis zehn Mal, um die Organoide mechanisch aufzubrechen. Verwenden Sie eine P200 Pipette, um eine 100-Mikroliter-Kuppel in der Mitte eines Brunnens einer vorgewärmten 12-Well-Platte zu erkennen. Wiederholen Sie dies, bis die gesamte BME-Lösung ausgegeben wird.
Dann die Platte vorsichtig auf einen Inkubator bei 37 Grad Celsius übertragen, damit sich das BME-Gel erstarren lässt. Nach 10 Minuten, holen Sie die Platte und fügen Sie einen Milliliter vorgewärmte Organoid komplette Medien zu jedem Brunnen. Organoidkulturen werden in der Regel über sieben bis zehn Tage je nach Kulturdichte und Proliferation durchdrungen.
Falls erforderlich, die Kulturen alle fünf Tage mit 200 Mikrolitern vorgewärmten Organoid-Komplettmedien auffüllen, um die Erschöpfung und Verdunstung des Wachstumsfaktors auszugleichen. Nach der Isolierung einzelner Zellen von Organoiden, resuspendieren Sie die einzelnen Zellen in einem Milliliter menschlichen organoiden vollständigen Medium. Verwenden Sie als Nächstes einen automatisierten Zellenzähler, um die Zellen zu zählen, um sicherzustellen, dass die Zelllebensfähigkeit erfasst wird.
Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen und lebensfähigen Zellen, die in der Ein-Milliliter-Suspension vorhanden sind. Entfernen Sie dann das Volumen, das 400.000 Zellen entspricht, und übertragen Sie es in ein neues Rohr. Fügen Sie organoide komplette Medien zu dieser Röhre hinzu, um das Volumen auf 7,2 Milliliter zu erhöhen.
Für therapeutische Tests bereiten Sie Zellen für die Beschichtung vor, indem Sie 800 Mikroliter BME mit 7,2 Milliliterorganoid-Komplettmedien mischen, die die Zellen auf Eis enthalten. Übertragen Sie die Mischung in ein auf Eis gehaltenes Reservoir und verwenden Sie eine 12-Kanal-Pipette, um 20 Mikroliter dieser Mischung in jeden Brunnen einer 384-Well-Platte zu verbuchen, was dazu führt, dass ca. 1.000 Zellen pro Brunnen plattiert werden. Dann drehen Sie die Platte bei 100 mal g für eine Minute in einem Schwenkeimer und legen Sie die Platte in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius.
Nach 24 Stunden verwenden Sie ein Brightfield-Mikroskop, um das Vorhandensein von Organoiden zu überprüfen. In dieser Studie werden patientenabgeleitete PDAC-Organoide isoliert, erweitert und charakterisiert. Um die Herausforderungen zu veranschaulichen, die mit der Isolierung von Organoiden aus PDAC verbunden sind, wird aus einer kleinen hypozellulären Tumorprobe eine repräsentative, vom Patienten abgeleitete Organoidkultur gebildet.
Organoide dürfen über einen Zeitraum von zwei Wochen größer werden und werden gemäß dem Protokoll durchgehen, um eine robustere Kultur zu etablieren. Einzelne Zellen aus einem etablierten und schnell wachsenden repräsentativen PDAC-Organoid werden dann vorbereitet, um das Ergebnis des Pharmakotypisierungsprotokolls zu demonstrieren. 1.000 lebensfähige Zellen werden in jedem Brunnen plattiert und können sich über einen Zeitraum von 24 Stunden erholen, bevor die zytotoxischen Chemotherapeutika dosiert werden.
Ein 9,0-Dosis-Assay wird in Dreifacharbeit durchgeführt, beginnend mit einer niedrigen Dosis von 100 Picomolar und endet mit einer hohen Dosis von zwei Mikromolaren. Nach einer fünftägigen Behandlung werden repräsentative Bilder für mit dem Fahrzeug behandelte Brunnen und mit der hohen Dosis jedes Chemotherapeutikums aufgenommen. Unmittelbar nach der Aufnahme der Bilder wird die Zelllebensfähigkeit mit einem lumineszierenden Zelllebensfähigkeitsreagenz bewertet und mit Graphik-Software gezeichnet.
Patienten-abgeleitete Organoide können heterogene Morphologien haben. Daher ist es wichtig, die enzymatischen Dissoziationen für jede einzelne Kultur zu optimieren. Die nachgelagerte Analyse von Patientenmodellen beinhaltet in der Regel eine Sequenzierung der DNA und der RNA der nächsten Generation.
Validieren Sie nach Möglichkeit die molekularen Eigenschaften der Modelle anhand von primären Gewebeproben. Individualisierte Organoidkulturen eröffnen die Möglichkeit personalisierter medizinischer Ansätze für Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs. Denken Sie daran, dass gefährliche Chemikalien wie Phenol-Chlor-Form und Chemotherapeutika mit geeigneten PSA und Sicherheitsausrüstung behandelt werden müssen.
