שיטה זו משמעותית מכיוון שמודלים אורגנואידיים שמקורם בחולה הם כלי רב עוצמה ומהיר לחקר סרטן הלבלב מכיוון שהם משקפים את ההטרוגניות הגנטית והפנוטיפית של מחלה זו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא אורגנואידים ניתן לבודד עם שיעור הצלחה גבוה מכמות מוגבלת של סרטן והם יכולים להיות מורחבים במהירות במבחנה לניתוח במורד הזרם. לימוד התגובה של אורגנואידים לתרופות ציטוטוקסיות עשוי לעזור לנו להבין מדוע גידולים הופכים עמידים לטיפול ולהגדיר אסטרטגיות טיפול יעילות יותר.
כדי להתחיל בהליך זה, לאחזר את צלחת 12 באר מוכן מן החממה. עם מרים תא סטרילי, בעדינות להרים את כיפה תמצית קרום המרתף כך שהוא צף במדיה המלאה תוך הקפדה להימנע מגרד את החלק התחתון של הבאר. באמצעות פיפטה P1000, בזהירות להעביר את כיפת BME ואת התקשורת לצינור חרוט 15 מיליליטר.
חזור על שלב זה עבור כל באר המכילה אורגנואידים. לשטוף בעדינות כל באר שנקטפו עם מיליליטר אחד של מדיה בזלית קרה ולהעביר את זה לשטוף את הצינור המכיל את האורגנואידים. מערבבים היטב את הפתרון ואת האורגנואידים עם פיפטה P1000 ומסתובבים למטה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות.
שכבה של BME המכיל אורגנואידים בהשעיה וכדור אורגנואיד יופיע בתחתית הצינור. בזהירות להסיר את supernatant הקפד למנוע כל אובדן של BME ושכבת organoid. מניחים את הצינור על קרח.
מוסיפים 10 מיליליטר של פתרון התאוששות תאים קרים כקרח לצינור ומערבבים ביסודיות על ידי היפוך. דגירה על קרח במשך 30 דקות תוך ערבוב כל שלוש דקות על ידי היפוך. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות.
גלולת organoid צריך להיות ברור בעוד שכבת BME צריך להיות נעלם. אם שכבת BME פוחתת בגודלה אך עדיין נראית לעין, דגירה למשך 30 דקות נוספות בארבע מעלות צלזיוס וחוזרת על הצנטריפוגה. לאחר BME כבר depolymerized, להסיר את פתרון שחזור התא תוך השארת מאחור גלולה organoid.
לשטוף את האורגנואידים עם 10 מיליליטר של מדיה בזלית על ידי ערבוב עם היפוך. צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות, להסיר את supernatant, ולה מניחים את הצינור עם גלולה organoid על הקרח לפחות חמש דקות. באופן אופציונלי, אם הכנת תא יחיד רצוי, להוסיף שלושה מיליליטר של טריפסין בתוספת 30 microliters של פתרון DNAse אני האורגנואידים.
הדגירה תגובה אנזימטית זו ב 37 מעלות צלזיוס עם היפוך עדין ערבוב כל שתי דקות עד 10 דקות. השתמש במיקרוסקופ של Brightfield כדי לפקח ולאשר שהדיסוציאציה של תא יחיד הצליחה. כדי לעצור את התגובה האנזימטית, להוסיף 10 מיליליטר של מדיה בזלית קרה קרח להסתובב למטה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות.
ואז להסיר את העל-טבעי. לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של מדיה בזלית על ידי ערבוב עם היפוך עדין. צנטריפוגה שוב ב 200 פעמים g במשך חמש דקות.
הסר את העל-טבעי וחזור על תהליך שטיפה וצנטריפוגה זה פעם נוספת. מניחים את הצינור עם גלולת התא על קרח לפחות חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף קרח קר BME לכדור התא ולהשתמש פיפטה P200 לערבב את הפתרון בעדינות עד שהוא הומוגני.
ואז למקם את קצה פיפטה קרוב לתחתית הצינור פיפטה למעלה ולמטה לפחות חמש עד 10 פעמים כדי לשבור מכנית את האורגנואידים. השתמשו בפיגט P200 כדי לזהות כיפת 100 מיקרוליטר במרכז באר של צלחת 12 בארות מחוממת מראש. חזור על הפעולה עד שכל פתרון ה- BME יפונה.
לאחר מכן מעבירים בזהירות את הצלחת לאנקובטור ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לג'ל BME להתגבש. לאחר 10 דקות, לאחזר את הצלחת ולהוסיף מיליליטר אחד של מדיה מלאה organoid מחומם מראש לכל באר. תרבויות אורגנואידיות בדרך כלל מעבר על פני שבעה עד 10 ימים בהתאם לצפיפות התרבות והתפשטות.
במידת הצורך, למעלה התרבויות עם 200 microliters של מדיה מלאה organoid מחומם מראש כל חמישה ימים כדי לפצות על דלדול גורם גדילה התאדות. לאחר בידוד תאים בודדים מאיברנואידים, יש לתרום מחדש את התאים הבודדים במיליליטר אחד של מדיה שלמה של אורגנואיד אנושי. לאחר מכן, השתמש ב מונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים המוודאים לתעד את הכדאיות של התא.
חשב את המספר הכולל של תאים ותאים בני קיימא הקיימים בהשעיה של מיליליטר אחד. לאחר מכן הסר את אמצעי האחסון השווה ל- 400, 000 תאים והעבר אותו לצינור חדש. הוסף מדיה מלאה organoid לצינור זה כדי להביא את עוצמת הקול עד 7.2 מיליליטר.
לבדיקות טיפוליות, הכינו תאים לבדיקה על ידי ערבוב של 800 מיקרוליטרים של BME עם 7.2 מיליליטר של מדיה מלאה אורגנואידית המכילה את התאים על הקרח. מעבירים את התערובת למאגר שנשמר על קרח ולהשתמש פיפטה 12 ערוצים כדי צלחת 20 microliters של תערובת זו לתוך כל באר של צלחת 384 באר וכתוצאה מכך כ 1,000 תאים להיות מצופה לתוך באר. ואז לסובב את הצלחת ב 100 פעמים גרם במשך דקה אחת בדלי נדנדה ולה מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור תרבות רקמות ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר 24 שעות, השתמש במיקרוסקופ של ברייטפילד כדי לבדוק נוכחות של אורגנואידים. במחקר זה, אורגנואיד PDAC שמקורו בחולה מבודדים, מורחבים ומאופיינים. כדי להמחיש את האתגרים הקשורים בידוד אורגנואידים מ PDAC, תרבות אורגנואידית המטופל הייצוגי הוקמה מדגם גידול צבוע קטן.
אורגנואידים מורשים לגדול על פני שבועיים והם מעבר על פי הפרוטוקול כדי להקים תרבות חזקה יותר. תאים בודדים מ organoid PDAC נציג הוקמה וגדל במהירות מוכנים לאחר מכן כדי להדגים את התוצאה של פרוטוקול פרמקוטיפינג. 1, 000 תאים קיימא מצופים בכל באר מותר להתאושש על פני תקופה של 24 שעות לפני סוכנים כימותרפיים cytotoxic הם מינון.
בדיקה במינון 9.0 מבוצעת ב- triplicate החל במינון נמוך של 100 פיקומולר וכלה במינון גבוה של שני מיקרומולרים. לאחר טיפול של חמישה ימים, תמונות נציג נלקחים עבור בארות שטופלו ברכב עם המינון הגבוה של כל סוכן כימותרפי. מיד לאחר צילום התמונות, הכדאיות התא מוערך באמצעות reagent הכדאיות התא זוהר התווה באמצעות תוכנת גרפים.
אורגנואידים שמקורם בחולה יכולים להיות מורפולוגיות הטרוגניים. לכן, חשוב לייעל את הדיסוציאציות האנזימטיות לכל תרבות. ניתוח במורד הזרם של מודלים שמקורם במטופלים כרוך בדרך כלל ברצף הדור הבא של הדנ"א וה-RNA.
במידת האפשר, לאמת את המאפיינים המולקולריים של המודלים באמצעות דגימות רקמה ראשוניות. תרבויות אורגנואידיות אינדיבידואליות פותחות את האפשרות לגישות רפואה מותאמות אישית לחולי סרטן הלבלב. זכור כי כימיקלים מסוכנים כגון פנול-כלורופורם וסוכנים כימותרפיים חייבים להיות מטופלים עם PPE מתאים וציוד בטיחות.
