Этот протокол предлагает стандартизированный метод определения идентичности и чистоты иммунных клеток, а также устраняет ограничение цитометрии потока, такие как большие требования к выборке, высокая изменчивость пользователя к пользователю и субъективный анализ данных. Этот анализ включает в себя автоматизированный шаблон анализа данных, который позволяет пользователям объективно оценивать идентичность и чистоту иммунных клеток. Это, наряду с несколькими контроля анализа предлагает под ключ, легко стандартизированный метод для оценки иммунной идентичности клеток и чистоты.
Демонстрацией этой техники будет Джерри Гузман, ученый в нашей лаборатории. После геномной изоляции ДНК от образца гематопоэтических клеток, представляющих интерес, используйте один микролитер геномной ДНК для измерения чистоты образца на спектрофотометре путем получения оптической плотности на 260, 280 и 230 нанометров. Далее разбавить от 400 до 1200 нанограммов геномного образца ДНК до конечного объема 142 микролитров с элюционным буфером из комплекта изоляции геномной ДНК.
Добавьте 75 микролитров калибратора в 67 микролитров буфера элюции. И разбавить 1200 нанограммов эталонной геномной ДНК общим объемом 142 микролитера с буфером элюции. Затем инкубировать трубки в течение пяти минут при 56 градусов по Цельсию и 900 оборотов в минуту в тепловой смеситель.
Для преобразования бисульфита добавьте 270 микролитров бисульфита аммония и 90 микролитров THFA во все трубки. И вихрь труб для обеспечения тщательного смешивания. Кратко спина вниз образцы для сбора жидкости и место труб в тепловой смеситель в течение 45 минут при 80 градусов по Цельсию и 900 оборотов в минуту.
Затем кратко спина вниз образцы снова и дайте им остыть до комнатной температуры в течение трех-пяти минут. Для очистки ДНК после преобразования бисульфита вихрь изоляции ДНК парамагнитных бусин в течение 30 секунд. Добавить этанол и изопропанол в буферы мытья в соответствии с объемами, перечисленными на бутылках.
Вихрь снова, пока бисер полностью resuspended и на 870 микролитров лиза связывания буфера и 105 микролитров ДНК связывания парамагнитных бусин для каждой трубки. Vortex трубки смешивать, прежде чем кратко спиннинг вниз образцов. Добавьте 570 микролитров 2-пропанола в каждую трубку и смешайте вихрем.
Инкубировать трубки в течение семи минут при комнатной температуре и 50 об /мин в минуту, прежде чем кратко спиннинг вниз труб снова и поместив их на магнитную стойку в течение пяти минут. В конце инкубации удалить супернат, не нарушая бисера. Вымойте образец буфером 1 и вихрем труб.
После краткой центрифугации поместите трубки обратно в стойку на три минуты и удалите супернат, не нарушая бисера. Вымойте образец дважды с буфером мытья 2 и высушить трубки при 65 градусах по Цельсию в течение 15 минут. Затем добавьте 60 буферов эволюции микролитров к каждой трубке.
После семиминутной инкубации при комнатной температуре и 1400 оборотов в минуту, кратко спина вниз труб и вернуть трубки в магнит в течение двух минут. В конце инкубации 55 микролитров бисульфита преобразуют ДНК, содержащуюся в новой трубке, не нарушая бисера. Для запуска количественных ПЦР в образцах назначьте каждому стандарту Task Standard в количественном программном обеспечении PCR и укажите окончательные номера копий в соответствии с таблицей.
Подготовьте серийные разбавления стандартной ДНК и подготовьте один количественный коктейль смеси ПЦР для целевого типа клеток. И один количественный PCR мастер смесь коктейль для GAPDH, в соответствии с таблицей. Загрузите три микролитров шаблона ДНК в соответствующие скважины 96 хорошо округлые нижней пластины следуют семь микролитров мастер смеси.
Когда все скважины были загружены печать пластины с количественной пленкой ПЦР и кратко спина пластины перед загрузкой его на количественный инструмент ПЦР. Затем запустите реакцию, как указано в таблице. По завершении запуска экспорт количественных данных ПЦР в качестве файла txt или xlsx.
После очистки бисульфита преобразуется ДНК с парамагнитных ударов, как попродемонстрировано, elute 25 микролитров ДНК. Передача бисульфита преобразуется ДНК в новую трубку и добавить два микролитера образца в отдельные трубки полосы ПЦР. Добавьте два микролитров воды в трубку управления шаблоном и подготовьте мастер-микс preamplification для всех образцов в соответствии с таблицей.
Добавьте 23 микролитров мастер-микса к каждой трубке и крышке, вихрю и кратко свяйте трубы. Затем запустите протокол предварительной упрощения на термохикере с помощью нагретой крышки. После завершения пробега, кратко спина вниз труб и передачи микролитров усиленных ДНК в новые трубы.
Затем разбавить образцы с 78 микролитров воды до 1 до 40 концентрации и запустить количественный ПЦР образцов, как попродемонстрировано. Здесь показаны репрезентативные данные анализа клеток CD8-T, полученные в результате анализа как периферической крови, моноядерных клеток, так и Т-клеток трех различных доноров, использующих как цитометрию потока, так и анализ метилирования. Тенденции между этими двумя методами для всех доноров в обоих типах клеток были схожими.
Эти репрезентативные данные из анализа Treg также показывают аналогичные результаты между методами. Однако во всех случаях этот анализ метилирования дал более высокие значения как при стимулируемых, так и в нестимулированных условиях. Чувствительность и специфичность каждого анализа была продемонстрирована пределом пустоты, пределом обнаружения и пределом значений количественной оценки.
Поскольку этот анализ предлагает автоматизированный шаблон анализа данных, он улучшает объективный анализ и увеличивает возможности стандартизации. Это идеально подходит для производства клеточной терапии, где стандартизированные методы имеют решающее значение для создания последовательного продукта клеточной терапии.
