Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methode zur Bestimmung der Immunzellidentität und -reinheit und befasst sich mit der Begrenzung der Durchflusszytometrie, wie z. B. großer Stichprobenbedarf, hoher Benutzervariabilität und subjektiver Datenanalyse. Dieser Test enthält eine automatisierte Datenanalysevorlage, die es Benutzern ermöglicht, die Identität und Reinheit von Immunzellen objektiv zu beurteilen. Dies, zusammen mit den multiplen Assay-Kontrollen bietet eine schlüsselfertige, leicht standardisierte Methode zur Beurteilung der Identität und Reinheit von Immunzellen.

Diese Technik wird Jerry Guzman demonstrieren, ein Wissenschaftler in unserem Labor. Verwenden Sie nach der genomischen DNA-Isolierung aus der hämatopoetischen Zellprobe einen Mikroliter der genomischen DNA, um die Reinheit der Probe auf einem Spektralphotometer zu messen, indem Sie die optische Dichte bei 260, 280 und 230 Nanometern erhalten. Als nächstes verdünnen 400 bis 1200 Nanogramm genomische DNA-Probe zu einem endletzten Volumen von 142 Mikrolitern mit Elutionspuffer aus einem genomischen DNA-Isolationskit.

75 Mikroliter des Kalibrators zu 67 MikroliterN Elutionspuffer hinzufügen. Und verdünnen Sie 1200 Nanogramm der Referenzgenom-DNA auf ein Gesamtvolumen von 142 Mikrolitern mit Elutionspuffer. Dann inkubieren Sie die Rohre für fünf Minuten bei 56 Grad Celsius und 900 Umdrehungen pro Minute in einem thermischen Mischer.

Für die Bisulfitumwandlung 270 Mikroliter Ammoniumbisulfit und 90 Mikroliter THFA in alle Röhren geben. Und Wirbel die Rohre, um eine gründliche Mischung zu gewährleisten. Drehen Sie die Proben kurz herunter, um die Flüssigkeit zu sammeln, und legen Sie die Rohre 45 Minuten lang bei 80 Grad Celsius und 900 Umdrehungen pro Minute in den Thermomischer.

Dann drehen Sie die Proben kurz wieder herunter und lassen Sie sie für drei bis fünf Minuten auf Raumtemperatur abkühlen. Zur DNA-Reinigung nach Bisulfitumwandlung die paramagnetischen Perlen der DNA-Isolierung 30 Sekunden lang wirbeln. Fügen Sie Ethanol und Isopropanol in die Waschpuffer entsprechend den auf den Flaschen aufgeführten Mengen hinzu.

Wieder Wirbel, bis die Perlen vollständig resuspendiert sind und bei 870 Mikroliter Lyse-Bindungspuffer und 105 Mikroliter der DNA-Bindung paramagnetische Perlen an jede Röhre. Wirbeln Sie die Rohre zu mischen, bevor Sie kurz die Proben nach unten drehen. Fügen Sie 570 Mikroliter 2-Propanol zu jedem Rohr und mischen durch Wirbeln.

Die Rohre sieben Minuten bei Raumtemperatur und 50 U/min pro Minute inkubieren, bevor Sie die Rohre kurz wieder herunterdrehen und fünf Minuten lang auf ein magnetisches Rack legen. Am Ende der Inkubation entfernen Sie das Supernate, ohne die Perlen zu stören. Waschen Sie die Probe mit Puffer 1 und wirbeln Sie die Rohre.

Nach einer kurzen Zentrifugation die Rohre für drei Minuten wieder in das Rack legen und das Supernate entfernen, ohne die Perlen zu stören. Die Probe zweimal mit Waschpuffer 2 waschen und die Rohre bei 65 Grad Celsius 15 Minuten trocknen. Als nächstes fügen Sie 60 Mikroliter Evolutionspuffer zu jeder Röhre hinzu.

Nach einer siebenminütigen Inkubation bei Raumtemperatur und 1400 Umdrehungen pro Minute drehen Sie die Rohre kurz herunter und geben sie für zwei Minuten zum Magneten zurück. Am Ende der Inkubation transferieren 55 Mikroliter des Bisulfites umgewandelte DNA, die in ein neues Rohr enthalten, ohne die Perlen zu stören. Um quantitative PCR auf den Stichproben auszuführen, weisen Sie jedem Standard den Task-Standard in der quantitativen PCR-Software zu und geben Sie die endgültigen Kopiernummern gemäß der Tabelle an.

Bereiten Sie serielle Verdünnungen der Standard-DNA vor und bereiten Sie einen quantitativen PCR-Master-Mix-Cocktail für den Zielzelltyp vor. Und ein quantitativer PCR-Master-Mix-Cocktail für GAPDH, so die Tabelle. Laden Sie drei Mikroliter der Schablonen-DNA in die entsprechenden Brunnen einer 96 gut abgerundeten Bodenplatte, gefolgt von sieben Mikrolitern Master-Mix.

Wenn alle Brunnen geladen sind, versiegeln Sie die Platte mit quantitativer PCR-Folie und drehen Sie die Platte kurz, bevor Sie sie auf das quantitative PCR-Instrument laden. Führen Sie dann die Reaktion wie in der Tabelle angegeben aus. Exportieren Sie die quantitativen PCR-Daten nach Abschluss der Ausführung als txt- oder xlsx-Datei.

Nach der Reinigung der Bisulfit umgewandelt e-DNA mit paramagnetischen Schlägen, wie gezeigt, elute 25 Mikroliter der DNA. Übertragen Sie die bisulfit konvertierte DNA in ein neues Rohr und fügen Sie zwei Mikroliter der Probe in einzelne PCR-Streifenröhren ein. Fügen Sie zwei Mikroliter Wasser zu einem Steuerelement ohne Schablone hinzu und bereiten Sie den Vorverstärkungs-Master-Mix für alle Proben entsprechend der Tabelle vor.

Fügen Sie 23 Mikroliter Master-Mix zu jeder Röhre und Kappe, Wirbel, und drehen Sie kurz nach unten die Rohre. Führen Sie dann das Vorverstärkungsprotokoll auf einem Thermocycler mit einem beheizten Deckel aus. Nach Abschluss des Laufs die Röhren kurz nach unten drehen und auf Mikroliter der verstärkten DNA in neue Röhren übertragen.

Dann verdünnen Sie die Proben mit 78 Mikroliter Wasser auf eine Eins bis 40 Konzentration und führen Sie eine quantitative PCR der Proben, wie gezeigt. Hier werden repräsentative Daten aus einem CD8+T-Zelltest gezeigt, der aus der Analyse sowohl peripheren Blutes, mononukleären Zellen und T-Zellen von drei verschiedenen Spendern mit Flusszytometrie als auch Methylierungstests gewonnen wurde. Die Trends zwischen den beiden Methoden bei allen Spendern in beiden Zelltypen waren ähnlich.

Diese repräsentativen Daten aus dem Treg-Assay zeigen auch ähnliche Ergebnisse zwischen den Methoden. In allen Fällen ergab dieser Methylierungstest jedoch höhere Werte sowohl unter stimulierten als auch unter unstimulierten Bedingungen. Die Empfindlichkeit und Spezifität jedes Assays wurde durch die Werte "Leergrenze", "Erkennungsgrenze" und "Limit of Quantitation" demonstriert.

Da dieser Test eine automatisierte Datenanalysevorlage bietet, verbessert er die objektive Analyse und erhöht die Standardisierungsfunktionen. Dies ist ideal für die Zelltherapieherstellung, bei der standardisierte Methoden entscheidend für die Schaffung eines konsistenten Zelltherapieprodukts sind.