פרוטוקול זה מציע שיטה מתוקנת לקביעת הזהות והטוהר של תאי החיסון, ומתייחס להגבלת ציטומטריית זרימה כגון דרישת מדגם גדולה, שונות גבוהה של המשתמש למשתמש וניתוח נתונים סובייקטיבי. מהערכה זו כוללת תבנית אוטומטית לניתוח נתונים המאפשרת למשתמשים להעריך את זהות תאי החיסון ואת טוהרם באופן אובייקטיבי. זה, יחד עם פקדי ההתזה מרובים מציע סוהר, שיטה מתוקנת בקלות להערכת זהות התא החיסוני וטוהר.
מדגים טכניקה זו יהיה ג'רי גוזמן, מדען במעבדה שלנו. לאחר בידוד DNA גנומי מדגם התא hematopoietic של עניין, להשתמש microliter אחד של ה-DNA הגנומי כדי למדוד את טוהר המדגם על ספקטרופוטומטר על ידי קבלת הצפיפות האופטית ב 260, 280 ו 230 ננומטר. הבא לדלל 400 כדי 1200 ננוגרם של דגימת DNA גנומי לנפח סופי של 142 microliters עם מאגר אלוטיון מערכת בידוד DNA גנומי.
הוסף 75 מיקרוליטרים של הכיול ל-67 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון. ולדלל 1200 ננוגרם של הדנ"א הגנומי הייחוס לנפח כולל של 142 מיקרוליטר עם מאגר אלוטיון. ואז להדק את הצינורות במשך חמש דקות ב 56 מעלות צלזיוס ו 900 מהפכות לדקה במיקסר תרמי.
להמרה ביסולפית, הוסיפו 270 מיקרוליטרים של אמוניום ביסולפיט ו-90 מיקרוליטרים של THFA לכל הצינורות. ומערבולת הצינורות כדי להבטיח ערבוב יסודי. בקצרה לסובב את הדגימות כדי לאסוף את הנוזל ולמקום את הצינורות במיקסר התרמי במשך 45 דקות ב 80 מעלות צלזיוס ו 900 מהפכות לדקה.
ואז לזמן קצר לסובב את הדגימות שוב ולאפשר להם להתקרר לטמפרטורת החדר במשך שלוש עד חמש דקות. לטיהור דנ"א בעקבות המרה ביסולפית, מערבולת נבזי הבידוד DNA 20 שניות. הוסף אתנול ו isopropanol למאגרי לשטוף על פי כרכים המפורטים על הבקבוקים.
מערבולת שוב עד חרוזים הם resuspended לחלוטין ב 870 microliters של חיץ קשירה תזה ו 105 microliters של חרוזים paramagnetic מחייב DNA לכל צינור. Vortex הצינורות לערבב לפני לזמן קצר מסתובב את הדגימות. מוסיפים 570 מיקרוליטרים של 2-פרופנול לכל צינור ומערבבים על ידי מערבולת.
הדגירה את הצינורות במשך שבע דקות בטמפרטורת החדר ו 50 סל"ד לדקה לפני לזמן קצר מסתובב במורד הצינורות שוב ומניח אותם על מתלה מגנטי במשך חמש דקות. בסוף הדגירה להסיר את supernate מבלי להפריע את חרוזים. לשטוף את המדגם עם חיץ 1 ומערבולת הצינורות.
לאחר צנטריפוגה קצרה מניחים את הצינורות בחזרה במדף במשך שלוש דקות ומסירים את supernate מבלי להפריע את חרוזים. לשטוף את המדגם פעמיים עם חיץ לשטוף 2 ולייבש את הצינורות ב 65 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר מכן, להוסיף 60 מאגר אבולוציה microliters לכל צינור.
לאחר דגירה של שבע דקות בטמפרטורת החדר ו-1400 סיבובים לדקה, סובבו לזמן קצר את הצינורות והחזירו את הצינורות למגנט לשתי דקות. בסוף הדגירה מעבירים 55 מיקרוליטרים של הדנ"א המומר של הביסולפיט המכיל לצינור חדש מבלי להפריע לבחנות. כדי להפעיל PCR כמותי בדוגמאות, הקצה לכל תקן את תקן המשימה בתוכנת PCR הכמותית וציין את מספרי ההעתקה הסופיים בהתאם לטבלה.
הכינו דילול סדרתי של דנ"א סטנדרטי והכינו קוקטייל תערובת מאסטר PCR כמותי אחד לסוג תא היעד. וקוקטייל אחד כמותי של PCR לערבב קוקטייל עבור GAPDH, על פי השולחן. לטעון שלושה microliters של ה-DNA תבנית לתוך הבארים המתאימים של צלחת תחתונה מעוגל היטב ואחריו שבעה microliters של תערובת אב.
כאשר כל בארות נטענו לאטום את הצלחת עם סרט PCR כמותי בקצרה לסובב את הצלחת לפני טעינתו על מכשיר PCR כמותי. לאחר מכן הפעל את התגובה כמצוין בטבלה. בסיום הריצה, יצא את נתוני PCR הכמותיים כקובץ txt או xlsx.
לאחר טיהור הדנ"א המומר הביסולפי עם פעימות פרמגנטיות כפי שהוכח, אלוט 25 microliters של ה-DNA. להעביר את ה-DNA מומר ביסולפיט לתוך צינור חדש ולהוסיף שני microliters של המדגם לתוך צינורות פס PCR בודדים. הוסיפו שני מיקרוליטרים של מים לצינור בקרה ללא תבנית והכינו את התערובת הראשית של ההזנה מראש לכל הדגימות לפי הטבלה.
מוסיפים 23 מיקרוליטרים של תערובת אב לכל צינור וכובע, מערבולת, ולסובב בקצרה את הצינורות. לאחר מכן הפעל את פרוטוקול טרום ההתאמות על רוכב אופניים תרמו באמצעות מכסה מחומם. לאחר סיום הריצה, סובבו בקצרה את הצינורות והעברו למיקרוליטרים של הדנ"א המוגבר לצינורות חדשים.
לאחר מכן לדלל את הדגימות עם 78 מיקרו ליטר מים לריכוז אחד עד 40 ולהפעיל PCR כמותי של הדגימות כפי שהוכח. כאן מוצגים נתונים מייצגים ממרשם תאים מסוג CD8+T המתקבל מניתוח דם היקפי, תאים מונונוקלאריים ותאי T משלושה תורמים שונים המשתמשים הן בציטומטריית זרימה והן במסיונות מתילציה. המגמות בין שתי השיטות בכל התורמים בשני סוגי התאים היו דומות.
נתונים מייצגים אלה של הבדיקה Treg גם להראות תוצאות דומות בין שיטות. עם זאת, בכל המקרים, בדיקה זו של מתילציה הניבה ערכים גבוהים יותר בתנאים מגורים ובלתי ניתנים לגירוי. הרגישות והספנטיות של כל תוכחה הוכחו על-ידי מגבלת ערכי הריק, מגבלת הזיהוי ומגבלת הכימות.
מכיוון שראיה זו מציעה תבנית אוטומטית לניתוח נתונים, היא משפרת ניתוח אובייקטיבי ומגבירה את יכולות הסטנדרטיזציה. זה אידיאלי עבור ייצור טיפול בתא שבו שיטות סטנדרטיות חיוניות ליצירת מוצר טיפול בתא עקבי.
