Questo protocollo offre un metodo standardizzato per determinare l'identità e la purezza delle cellule immunitarie e affronta la limitazione della citometria del flusso come un grande requisito di campionamento, un'elevata variabilità da utente a utente e analisi soggettiva dei dati. Questo test include un modello di analisi automatizzata dei dati che consente agli utenti di valutare oggettivamente l'identità e la purezza delle cellule immunitarie. Questo, insieme ai molteplici controlli di dosaggio offre un metodo chiavi in mano e facilmente standardizzato per valutare l'identità e la purezza delle cellule immunitarie.
A dimostrare questa tecnica sarà Jerry Guzman, uno scienziato del nostro laboratorio. Dopo l'isolamento del DNA genomico dal campione di cellule ematopoietiche di interesse, utilizzare un microlitro del DNA genomico per misurare la purezza del campione su uno spettrofotometro ottenendo la densità ottica a 260, 280 e 230 nanometri. Successivamente diluire da 400 a 1200 nanogrammi di campione di DNA genomico a un volume finale di 142 microlitri con tampone di eluizione da un kit di isolamento genomico del DNA.
Aggiungere 75 microlitri del calibratore a 67 microlitri di tampone di eluizione. E diluire 1200 nanogrammi del DNA genomico di riferimento a un volume totale di 142 microlitri con tampone di eluizione. Quindi incubare i tubi per cinque minuti a 56 gradi Celsius e 900 giri al minuto in un miscelatore termico.
Per la conversione della bisolfito, aggiungere 270 microlitri di bisolfito di ammonio e 90 microlitri di THFA a tutti i tubi. E vortice i tubi per garantire una miscelazione accurata. Far girare brevemente i campioni per raccogliere il liquido e posizionare i tubi nel miscelatore termico per 45 minuti a 80 gradi Celsius e 900 giri al minuto.
Quindi far girare brevemente di nuovo i campioni e consentire loro di raffreddare a temperatura ambiente per tre o cinque minuti. Per la purificazione del DNA dopo la conversione della bisolfito, vortice le perline paramagnetiche di isolamento del DNA per 30 secondi. Aggiungere etanolo e isopropanolo ai tamponi di lavaggio in base ai volumi elencati sulle bottiglie.
Vortice di nuovo fino a quando le perline sono completamente rimescolate e a 870 microlitri di tampone legante di lysis e 105 microlitri del DNA che legano perline paramagnetiche ad ogni tubo. Vortice i tubi da mescolare prima di girare brevemente i campioni. Aggiungere 570 microlitri di 2-propanolo ad ogni tubo e mescolare con vortici.
Incubare i tubi per sette minuti a temperatura ambiente e 50 giri/min al minuto prima di far girare brevemente di nuovo i tubi e posizionarli su un rack magnetico per cinque minuti. Alla fine dell'incubazione rimuovere il supernate senza disturbare le perline. Lavare il campione con tampone 1 e vortice i tubi.
Dopo una breve centrifugazione riposizionare i tubi nel rack per tre minuti e rimuovere il supernate senza disturbare le perline. Lavare il campione due volte con tampone di lavaggio 2 e asciugare i tubi a 65 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, aggiungere 60 microlitri buffer di evoluzione ad ogni tubo.
Dopo sette minuti di incubazione a temperatura ambiente e 1400 rotazioni al minuto, girare brevemente i tubi e riportare i tubi al magnete per due minuti. Al termine dell'incubazione trasferiscono 55 microlitri del DNA convertito in bisolfito contenente in un nuovo tubo senza disturbare le perline. Per eseguire pcr quantitativi sui campioni, assegnare a ciascuno standard lo standard di attività nel software PCR quantitativo e specificare i numeri di copia finale in base alla tabella.
Preparare diluizioni seriali del DNA standard e preparare un cocktail di master mix PCR quantitativo per il tipo di cellula target. E un cocktail mix master PCR quantitativo per GAPDH, secondo la tabella. Caricare tre microlitri del DNA del modello nei pozzi appropriati di una piastra inferiore a 96 angoli ben arrotondati seguita da sette microlitri di master mix.
Quando tutti i pozzi sono stati caricati sigillare la piastra con pellicola PCR quantitativa e ruotare brevemente la piastra prima di caricarla sullo strumento PCR quantitativo. Quindi eseguire la reazione come indicato nella tabella. Al termine dell'esecuzione, esportare i dati quantitativi pcr come file txt o xlsx.
Dopo aver purificato il DNA convertito con bisolfito con battiti paramagnetici come dimostrato, elute 25 microlitri del DNA. Trasferire il DNA convertito dalla bisolfito in un nuovo tubo e aggiungere due microlitri del campione in singoli tubi a strisce PCR. Aggiungere due microlitri d'acqua a un tubo di controllo senza modello e preparare la miscela principale di preamplificazione per tutti i campioni in base alla tabella.
Aggiungere 23 microlitri di master mix a ciascun tubo e cappuccio, vortice e far girare brevemente i tubi. Quindi eseguire il protocollo di preamplificazione su un termociclore utilizzando un coperchio riscaldato. Al termine della corsa, far girare brevemente i tubi e trasferirli ai microlitri del DNA amplificato in nuovi tubi.
Quindi diluire i campioni con 78 micro litri di acqua a una concentrazione da uno a 40 ed eseguire una PCR quantitativa dei campioni come dimostrato. Qui vengono mostrati i dati rappresentativi di un saggio di cellule CD8+T ottenuti analizzando sia il sangue periferico, le cellule mononucleari, sia le cellule T di tre diversi donatori usando sia la citometria a flusso che i saggi di metilazione. Le tendenze tra i due metodi tra tutti i donatori in entrambi i tipi di cellule erano simili.
Questi dati rappresentativi del saggio Treg mostrano anche risultati simili tra i metodi. Tuttavia, in tutti i casi, questo saggio di metilazione ha prodotto valori più elevati sia in condizioni stimolate che non stimolate. La sensibilità e la specificità di ogni saggio sono state dimostrate dai valori limite di vuoto, limite di rilevamento e limite di quantificazione.
Poiché questo test offre un modello di analisi dei dati automatizzato, migliora l'analisi obiettiva e aumenta le capacità di standardizzazione. Questo è l'ideale per la produzione di terapia cellulare in cui i metodi standardizzati sono cruciali per la creazione di un prodotto di terapia cellulare coerente.
