Este protocolo oferece um método padronizado para determinar a identidade e a pureza das células imunes, e aborda a limitação da citometria de fluxo, como grande exigência de amostra, alta variabilidade do usuário e análise subjetiva de dados. Este ensaio inclui um modelo automatizado de análise de dados que permite que os usuários avaliem a identidade e a pureza das células imunes objetivamente. Isso, juntamente com os múltiplos controles de ensaio, oferece um método de chave de fenda, facilmente padronizado para avaliar a identidade e a pureza das células imunes.
Demonstrando essa técnica será Jerry Guzman, um cientista em nosso laboratório. Após o isolamento genômico do DNA da amostra de interesse hematopoiética, use um microliter do DNA genômico para medir a pureza da amostra em um espectotógrafo, obtendo a densidade óptica em 260, 280 e 230 nanômetros. Em seguida diluir 400 a 1200 nanogramas de amostra de DNA genômico para um volume final de 142 microliters com tampão de elução de um kit de isolamento de DNA genômico.
Adicione 75 microliters do calibrador a 67 microliters de tampão de elução. E diluir 1200 nanogramas do DNA genômico de referência para um volume total de 142 microliters com tampão de eluição. Em seguida, incubar os tubos por cinco minutos a 56 graus Celsius e 900 revoluções por minuto em uma batedeira térmica.
Para conversão de bisulfato, adicione 270 microliters de bissulfito de amônio e 90 microliters de THFA a todos os tubos. E vórtice dos tubos para garantir uma mistura completa. Gire brevemente as amostras para coletar o líquido e coloque os tubos na batedeira térmica por 45 minutos a 80 graus Celsius e 900 rotações por minuto.
Em seguida, gire brevemente as amostras novamente e deixe esfriar a temperatura ambiente por três a cinco minutos. Para purificação de DNA após a conversão de bisulfato, vórtice o isolamento de DNA contas paramagnéticas por 30 segundos. Adicione etanol e isopropanol aos buffers de lavagem de acordo com os volumes listados nas garrafas.
Vórtice novamente até que as contas sejam completamente resuspended e em 870 microliters de tampão de ligação de lise e 105 microliters das contas paramagnéticas de ligação de DNA a cada tubo. Vórtice os tubos para misturar antes de girar brevemente as amostras. Adicione 570 microliters de 2-propanol a cada tubo e misture por vórtice.
Incubar os tubos por sete minutos em temperatura ambiente e 50 RPM por minuto antes de girar brevemente os tubos novamente e colocá-los em um rack magnético por cinco minutos. No final da incubação remova o supernato sem perturbar as contas. Lave a amostra com tampão 1 e vórtice dos tubos.
Depois de uma breve centrifugação coloque os tubos de volta no rack por três minutos e remova o supernato sem perturbar as contas. Lave a amostra duas vezes com tampão de lavagem 2 e seque os tubos a 65 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, adicione 60 microliters evolutivo tampão a cada tubo.
Após uma incubação de sete minutos à temperatura ambiente e 1400 rotações por minuto, gire brevemente os tubos e devolva os tubos ao ímã por dois minutos. No final da transferência de incubação 55 microliters do bisullfita converteram DNA contendo um novo tubo sem perturbar as contas. Para executar o PCR quantitativo nas amostras, atribua a cada padrão o Padrão de Tarefa no software PCR quantitativo e especifique os números finais de cópia de acordo com a tabela.
Prepare diluições seriais do DNA padrão e prepare um coquetel de mistura mestre pcr quantitativo para o tipo de célula alvo. E um coquetel de mistura mestre pcr quantitativo para GAPDH, de acordo com a tabela. Carregue três microliters do DNA do modelo nos poços apropriados de uma placa inferior bem arredondada de 96 seguidos por sete microliters de mistura mestre.
Quando todos os poços tiverem sido carregados, sele a placa com filme PCR quantitativo e gire brevemente a placa antes de carregá-la no instrumento PCR quantitativo. Em seguida, execute a reação como indicado na tabela. Na conclusão do execute, exporte os dados quantitativos do PCR como um arquivo txt ou xlsx.
Depois de purificar o bisulfoto converteu DNA com batidas paramagnéticas como demonstrado, elute 25 microliters do DNA. Transfira o DNA convertido bisulfo em um novo tubo e adicione dois microliters da amostra em tubos individuais de tira PCR. Adicione dois microliters de água a um tubo de controle sem modelo e prepare a mistura mestre de pré-amplificação para todas as amostras de acordo com a tabela.
Adicione 23 microliters de mistura mestre a cada tubo e tampa, vórtice, e gire brevemente os tubos. Em seguida, execute o protocolo de pré-amplificação em um ciclo de termopescar usando uma tampa aquecida. Após a execução ser concluída, gire brevemente os tubos e transfira para microliters do DNA amplificado para novos tubos.
Em seguida, diluir as amostras com 78 micro litros de água para uma concentração de um a 40 e executar um PCR quantitativo das amostras como demonstrado. Aqui, dados representativos de um ensaio celular CD8+T obtidos a partir da análise tanto do sangue periférico, das células mononucleares e das células T de três doadores diferentes usando os ensaios de citometria de fluxo e metilação são mostrados. As tendências entre os dois métodos entre todos os doadores em ambos os tipos de células foram semelhantes.
Esses dados representativos do ensaio Treg também mostram resultados semelhantes entre os métodos. No entanto, em todos os casos, este ensaio de metilação produziu valores mais elevados em condições estimuladas e não estimuladas. A sensibilidade e especificidade de cada ensaio foi demonstrada pelo Limite de Em Branco, Limite de Detecção e Limite de Valores de Quantitação.
Como este ensaio oferece um modelo automatizado de análise de dados, ele melhora a análise objetiva e aumenta os recursos de padronização. Este é ideal para a fabricação de terapia celular onde métodos padronizados são cruciais para a criação de um produto de terapia celular consistente.
