Este protocolo ofrece un método estandarizado para determinar la identidad y pureza de las células inmunitarias, y aborda la limitación de la citometría de flujo, como el requisito de muestra grande, la alta variabilidad de usuario a usuario y el análisis de datos subjetivos. Este ensayo incluye una plantilla de análisis de datos automatizada que permite a los usuarios evaluar objetivamente la identidad y pureza de las células inmunitarias. Esto, junto con los múltiples controles de ensayo, ofrece un método llave en mano y fácilmente estandarizado para evaluar la identidad y pureza de las células inmunitarias.
Demostrando esta técnica estará Jerry Guzmán, un científico en nuestro laboratorio. Después del aislamiento genómico del ADN de la muestra de células hematopoyéticas de interés, utilice un microlitro del ADN genómico para medir la pureza de la muestra en un espectrofotómetro obteniendo la densidad óptica a 260, 280 y 230 nanómetros. A continuación diluir de 400 a 1200 nanogramos de muestra de ADN genómico a un volumen final de 142 microlitros con tampón de elución de un kit de aislamiento de ADN genómico.
Agregue 75 microlitros del calibrador a 67 microlitros de tampón de elución. Y diluir 1200 nanogramos del ADN genómico de referencia a un volumen total de 142 microlitros con tampón de elución. Luego incubar los tubos durante cinco minutos a 56 grados Centígrados y 900 revoluciones por minuto en un mezclador térmico.
Para la conversión de bisulfito, añada 270 microlitros de bisulfito de amonio y 90 microlitros de THFA a todos los tubos. Y vórtice los tubos para asegurar una mezcla completa. Gire brevemente las muestras para recoger el líquido y colocar los tubos en la mezcladora térmica durante 45 minutos a 80 grados Celsius y 900 revoluciones por minuto.
A continuación, vuelva a girar brevemente las muestras y deje que se enfríen a temperatura ambiente durante tres a cinco minutos. Para la purificación del ADN después de la conversión de bisulfito, vórtice las perlas paramagnéticas de aislamiento de ADN durante 30 segundos. Añadir etanol e isopropanol a los tampones de lavado de acuerdo con los volúmenes enumerados en las botellas.
Vórtice de nuevo hasta que las perlas se resuspenden por completo y a 870 microlitros de tampón de unión a la lysis y 105 microlitros de las perlas paramagnéticas de unión al ADN a cada tubo. Vórtice los tubos para mezclar antes de girar brevemente hacia abajo las muestras. Añadir 570 microlitros de 2-propanol a cada tubo y mezclar por vórtice.
Incubar los tubos durante siete minutos a temperatura ambiente y 50 RPM por minuto antes de girar brevemente los tubos de nuevo y colocarlos en un bastidor magnético durante cinco minutos. Al final de la incubación retirar el supernate sin alterar las cuentas. Lave la muestra con el tampón 1 y vórtice los tubos.
Después de una breve centrifugación coloque los tubos de nuevo en el estante durante tres minutos y retire el supernado sin alterar las cuentas. Lave la muestra dos veces con el tampón de lavado 2 y seque los tubos a 65 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, agregue 60 microlitros de tampón de evolución a cada tubo.
Después de una incubación de siete minutos a temperatura ambiente y 1400 rotaciones por minuto, gire brevemente por los tubos y devuelva los tubos al imán durante dos minutos. Al final de la transferencia de incubación 55 microlitros del ADN bisulfito convertido que contienen un nuevo tubo sin alterar las perlas. Para ejecutar PCR cuantitativo en las muestras, asigne a cada estándar el estándar de tareas en el software de PCR cuantitativo y especifique los números de copia finales de acuerdo con la tabla.
Preparar diluciones en serie de ADN estándar y preparar un cóctel de mezcla maestra de PCR cuantitativo para el tipo de célula objetivo. Y un cóctel de mezcla maestra de PCR cuantitativo para GAPDH, según la mesa. Cargue tres microlitros del ADN de la plantilla en los pozos apropiados de una placa inferior 96 bien redondeada seguida de siete microlitros de mezcla maestra.
Cuando se hayan cargado todos los pozos, selle la placa con película PCR cuantitativa y gire brevemente la placa antes de cargarla en el instrumento PCR cuantitativo. A continuación, ejecute la reacción como se indica en la tabla. Al finalizar la ejecución, exporte los datos cuantitativos de PCR como un archivo txt o xlsx.
Después de purificar el ADN convertido bisulfito con latidos paramagnéticos como se demostró, eluir 25 microlitros del ADN. Transfiera el ADN convertido de bisulfito en un nuevo tubo y añada dos microlitros de la muestra en tubos de tira de PCR individuales. Añadir dos microlitros de agua a un tubo de control sin plantilla y preparar la mezcla maestra de preamplificación para todas las muestras de acuerdo con la tabla.
Agregue 23 microlitros de mezcla maestra a cada tubo y tapa, vórtice, y gire brevemente por los tubos. A continuación, ejecute el protocolo de preamplificación en un termociclista utilizando una tapa calentada. Una vez completada la carrera, gire brevemente los tubos y transfiera a los microlitros del ADN amplificado a nuevos tubos.
A continuación, diluir las muestras con 78 micro litros de agua a una concentración de uno a 40 y ejecutar una PCR cuantitativa de las muestras como se ha demostrado. Aquí, se muestran datos representativos de un ensayo de células CD8+T obtenidos a partir del análisis de sangre periférica, células mononucleares y células T de tres donantes diferentes que utilizan ensayos de citometría de flujo y metilación. Las tendencias entre los dos métodos en todos los donantes en ambos tipos de células fueron similares.
Estos datos representativos del ensayo Treg también muestran resultados similares entre métodos. Sin embargo, en todos los casos, este ensayo de metilación produjo valores más altos en condiciones estimuladas y no estimuladas. La sensibilidad y especificidad de cada ensayo se demostró mediante los valores Límite de en blanco, Límite de detección y Límite de cuantificación.
Dado que este ensayo ofrece una plantilla de análisis de datos automatizada, mejora el análisis de objetivos y aumenta las capacidades de estandarización. Esto es ideal para la fabricación de terapia celular donde los métodos estandarizados son cruciales para crear un producto de terapia celular consistente.
