هذه التقنية لإنتاج وباء الأنفلونزا الفيروسية وتحديد العدوى يمكن تبسيط البحوث من فيروس الانفلونزا في مدينة BSL-2. قمنا بالتطبيع PPS للعدوى على أساس qRT-PCR البيانات من PPS. يتم ترميز اثنين من تعبير الجليكوبروتين plasmid، والتي يمكن تبسيط البحوث على reassortment الفيروس.
بعد يوم واحد من بذر الخلية، تحقق من مورفولوجيا الخلية وكثافتها تحت مجهر ضوء مقلوب. من الناحية المثالية يجب أن تكون الخلية 85٪ تقريبًا التقاء عند نقل الدم. استبدال المتوسطة مع ملليلتر واحد من DMEM خالية من المصل في بئر، ووضع لوحة مرة أخرى في الحاضنة.
لكل بئر من الخلايا التي سيتم نقلها، تمييع ثمانية ميكرولترات من كاشف transfection إلى حجم 150 ميكرولترات مع انخفاض متوسط المصل. اخلطي الحل بلطف واتركه يجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. وفي الوقت نفسه، تمييع 2.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى 158 ميكرولترات من متوسط المصل المخفض.
بعد فترة الحضانة لمدة خمس دقائق، اجمع الحمض النووي المخفف مع كاشف الانبعاثات المخفف، واخلط المحلّل بلطف واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. إضافة مجمع الدهون الحمض النووي إلى الآبار المقابلة مع الخلايا في المتوسطة خالية من المصل. ثم اخلطي الطبق بلطف عن طريق الهزاز ذهابا وإيابا.
احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع إلى ست ساعات. بعد الحضانة، وإزالة المتوسطة واستبدالها مع ملليلتر اثنين من DMEM في بئر. ثم احتضانه لمدة 36 إلى 48 ساعة أخرى.
بذور كل نوع من الخلايا المعرضة في 10،000 الخلايا في بئر و 96 لوحة جيدا. ثم اترك اللوحة ليلاً في حاضنة لثاني أكسيد الكربون بنسبة 37 درجة مئوية وخمسة في المئة. في اليوم الثالث بعد عملية نقل، تحقق من لون الوسط الذي يجب أن يضيء الوردي أو البرتقالي قليلاً وفحص الخلايا مع المجهر البيولوجي المقلوب تحت الطول الموجي نانومتر 440 إلى 460 نانومتر.
في 38 إلى 48 ساعة بعد ما بعد transfection، حصاد الجسيمات pseuotyped أو PPS عن طريق تمرير لهم من خلال مرشح غشاء فلوريد بولي فينيلينيد ميكرومتر 0.45 للقضاء على حطام الخلايا، ثم تقسيمها إلى aliquots حجم صغير وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. لتحديد كمية PPS، نقل 30 ميكرولترات من الجسيمات الفيروسية النقية إلى أنبوب 1.5 ميكرولتر RNase خالية وإضافة ميكرولتر واحد من نوكلياز بنزوناز. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للقضاء على أي الحمض النووي والحمض النووي الريبي التلوث.
بعد الحضانة، وتجميد العينة إلى ناقص 70 درجة مئوية إلى النوى النشطة وإضافة اثنين microliters من البروتينات K.احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة لهضم البروتينات المغلف والافراج عن الحمض النووي CMV-GFP RNA. ثم غير نشط البروتينات K في 100 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. كمّيّة ال [بيس] مع كمّيّة عكس نسخة [رPCR] يستعمل المجسّم عالميّة [ون-ستت] [رت-هكّر] [رتّر] [ا] [رسّل] في التمهيديّة والتحقيقات يعيّن في النصّ مخطوطة.
تطبيع PPS إلى أربع مرات 10 إلى الخامس نسخ الجيش الملكي النيبالي لكل ملليلتر. ثم إضافة TPCK-التربسين إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر في PPS التي تؤوي H7N9 hemagglutinin. احتضان PPS في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتشكيل وحدات فرعية وظيفية HA1 و HA2.
اخلطي الـ PPS المُطَيَّر مع وسيط DMEM بنسبة واحدة إلى واحدة، ثم أحضري اللوحة التي تحتوي على خلايا عرضة لخزانة السلامة البيولوجية. استلهمي المابير ويغسل الخلايا مرة واحدة مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني مُدفأ مسبقاً. إضافة 100 ميكرولتردات من PPS-DMEM خليط في كل بئر، ثلاثية اختبارات العدوى من كل نوع من PPS إلى خط خلية واحد عرضة.
احتضان لوحة لمدة أربع إلى ست ساعات في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثم pirate المابير واستبداله مع 100 ميكرولترات من DCM احتضان لوحة لآخر 24 إلى 36 ساعة قبل الكشف عن العدوى. نتائجنا هي PPS تعتبر الآن المعدية للناس.
لذلك ينصح بإجراءات الحراسة الآمنة الضرورية لاتخاذ مثل ارتداء قناع وأداء المقايسات العدوى في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. وكان هذا البروتوكول توليد لتوليد 10 أنواع من الجزيئات الزائفة أو PPS مع اثنين من hemaglutininin تجميع ونيولامينيداز فيروس التهاب الفم في الوريد G ج جليكوبروتين أو لا يوجد مظروف glycoproteins. تم تصوير PPS مع المجهر الإلكترون انتقال وتم تقييم العدوى في خطين من الخلايا، A549 و MDCK.
في مجموعة PPS إيواء H5، كانت العدوى من H5N1، H5 زائد N9 و H5 حوالي 90٪ 18٪ و 10٪ لخط الخلية A549 و 40٪ 5٪ و 5٪ لMCK، على التوالي. في مجموعة PPS إيواء H7، كانت العدوى من H7N9، H7 زائد N1 و H7 ما يقرب من 10٪ 7٪ و 1٪ لخط الخلية A549 و 8٪ 4٪ و 1٪ لMMCK، على التوالي. وكان العدوى من التهاب الفم في الوريد فيروس G الجليكوبروتين PP حوالي 21٪ ل A549 و 16٪ لخلايا MDCK.
في حين أن دلتا المغلف الجليكوبروتين PP أظهرت عدم العدوى. من المهم أن نتذكر أن PP منتج HEK-293T/17 الخلايا تشكل الأساس لهذا الإجراء. لذلك النمو الأمثل يعلمنا خلايا HEK-293T/17 هو الأكثر أهمية.
بعد هذا الإجراء أو بعض الاختبارات الأخرى مثل L2 يمكن إجراء فحص المحيط. هذا المقايسة يمكن أن تعطي تقريبا التخلص من الخصائص البيولوجية للتفضيل مستقبلات ونمط سوف تكشف عن tropism من PPS. منذ أن أخذوا البروتينات من فيروس الانفلونزا يتم استنساخها في اثنين زائد ماكس.
يمكن دراسة ها والبروتينات NA بشكل منفصل لذلك نحن reassortment بينهما. ويمكن استكشاف المسوخ والآثار الناضجة.
