Essa técnica de produção de influenza viral PP e determinação de sua infectividade pode simplificar a pesquisa do vírus da gripe em uma cidade BSL-2. Normalizamos o PPS para as infecções com base em dados qRT-PCR do PPS. Duas expressãos de glicoproteína plasmídeos são codificados, o que pode simplificar a pesquisa sobre a reassortação do vírus.
Um dia após a semeadura celular, verifique a morfologia celular e a densidade sob um microscópio de luz invertida. O ideal é que a célula seja aproximadamente 85% confluente na transfecção. Substitua o meio por um mililitro de DMEM sem soro por poço, e coloque a placa de volta na incubadora.
Para cada poço de células a serem transfeccionadas, diluir oito microliters do reagente de transfecção a um volume de 150 microliters com meio soro reduzido. Misture a solução suavemente e deixe-a sentada à temperatura ambiente por cinco minutos. Enquanto isso, diluem 2,5 microgramas de DNA plasmídeo em 158 microliters de meio soro reduzido.
Após a incubação de cinco minutos, combine o DNA diluído com reagente de transfecção diluído, misture suavemente a solução e deixe-a em temperatura ambiente por 15 minutos. Adicione o complexo lipídedo de DNA aos poços correspondentes com as células em meio livre de soro. Em seguida, misture a placa suavemente balançando para frente e para trás.
Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro a seis horas. Após a incubação, remova o meio e substitua-o por dois mililitros de DMEM por poço. Em seguida, incuba-lo por mais 36 a 48 horas.
Semente cada tipo de célula suscetível a 10.000 células por poço e uma placa de 96 poços. Em seguida, deixe a placa durante a noite em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No terceiro dia após a transfecção, verifique a cor do meio que deve iluminar rosa ou ligeiramente laranja e examine as células com um microscópio biológico florescente invertido sob 440 a 460 nanômetros de comprimento de onda.
Em 38 a 48 horas após a transfecção, colde as partículas de pseuotipadas ou PPS passando-as através de um filtro de membrana de fluoreto de polivinida de 0,45 micrômetro para eliminar detritos celulares, em seguida, divida-as em alíquotas de pequeno volume e armazene-as a menos 80 graus Celsius. Para quantificar o PPS, transfira 30 microlitadores das partículas virais purificadas para um tubo 1,5 microliter RNase sem dna e adicione um microliter de Benzonase Nuclease. Incubar o tubo a 37 graus Celsius por uma hora para eliminar qualquer contaminação de DNA e RNA.
Após a incubação, congele a amostra a menos 70 graus Celsius para ativo a nuclease e adicione dois microliters de Proteinase K.Incubar a mistura por 30 minutos para digerir as proteínas do envelope e liberar o RNA CMV-GFP. Em seguida, inativo o Proteinase K a 100 graus Celsius por três minutos. Quantifique o PPS com transcrição reversa quantitativa RTPCR usando o Kit RT-qPCR Universal Probe One-Step nos primers e sondas especificados no manuscrito do texto.
Normalize o PPS para quatro vezes 10 a quinto RNA cópias por mililitro. Em seguida, adicione tpck-trypsin a uma concentração final de 10 microgramas por mililitro no PPS que abriga hemaglutina H7N9. Incubar o PPS a 37 graus Celsius durante uma hora para formar as subunidades funcionais HA1 e HA2.
Misture o PPS normalizado com o meio DMEM em uma proporção de um para um, em seguida, leve a placa contendo células suscetíveis ao armário de biossegurança. Aspire o supernascer e lave as células uma vez com 100 microliters de PBS pré-aquecido. Adicione 100 microliters de mistura PPS-DMEM em cada poço, triplicando os testes de infectividade de cada tipo de PPS a uma linha celular suscetível.
Incubar a placa por quatro a seis horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, aspire o supernascer e substitua-o por 100 microliters de DCM Incubar a placa por mais 24 a 36 horas antes da detecção de infectividade. Nossos resultados são pps são considerados agora infecciosos para as pessoas.
Assim, os procedimentos necessários de guarda segura são recomendados para tomar, como usar uma máscara e realizar os ensaios de infectividade em um armário de biossegurança. Este protocolo foi gerado para gerar 10 tipos de partículas pseudotipadas ou PPS com duas hemaglutinina agrupadas e estomatite vesicular de neuraminidase vírus G glicoproteína ou sem glicoproteínas envelope. O PPS foi imageado com microscopia eletrônica de transmissão e sua infectividade foi avaliada em duas linhas celulares, A549 e MDCK.
No grupo PPS que abriga h5, a infectividade de H5N1, H5 mais N9 e H5 foi de aproximadamente 90%18% e 10% para a linha celular A549 e 40%5% e 5% para MDCK, respectivamente. No grupo PPS que abriga h7, a infectividade de H7N9, H7 mais N1 e H7 foi de aproximadamente 10%7% e 1% para a linha celular A549 e 8%4% e 1% para MDCK, respectivamente. A infectividade do vírus da estomatite vesicular G glicoproteína PP foi de cerca de 21% para células A549 e 16% para MDCK.
Enquanto o envelope delta glicoproteins PP não mostrou infectividade. É fundamental lembrar que as células HEK-293T/17 do produtor de PP constituem a base deste procedimento. Assim, o crescimento ideal nos ensina células HEK-293T/17 é o mais importante.
Após este procedimento ou algum outro teste, como o recept L2, o ensaio delimitante pode ser realizado. Este ensaio pode quase livrar-se das peculiaridades biológicas da preferência do receptor e o padrão revelará o tropismo do PPS. Desde que tomaram as glicoproteínas do vírus da gripe são clonadas em duas mais máximas.
As proteínas HA e NA podem ser estudadas separadamente, por isso nos reassortamos entre elas. Os mutantes e os efeitos maduros podem ser explorados.
