Esta técnica de producción de PP viral de gripe y determinar su infectividad puede simplificar la investigación del virus de la gripe en una ciudad BSL-2. Normalizamos el PPS para las infecciones basado en datos qRT-PCR de PPS. Se codifican dos plásmidos de expresión de glicoproteína, lo que puede simplificar la investigación sobre la reordenación de virus.
Un día después de la siembra celular, compruebe la morfología celular y la densidad bajo un microscopio de luz invertido. Idealmente la célula debe ser aproximadamente 85%confluente en la transfección. Sustituya el medio por un mililitro de DMEM sin suero por pozo y vuelva a colocar la placa en la incubadora.
Para cada pocero de células a trans infectar, diluir ocho microlitros del reactivo de transfección a un volumen de 150 microlitros con medio sérico reducido. Mezclar la solución suavemente y dejar reposar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Mientras tanto, diluir 2,5 microgramos de ADN plásmido en 158 microlitros de medio sérico reducido.
Después de la incubación de cinco minutos, combinar el ADN diluido con el reactivo de transfección diluido, mezclar suavemente la solución y dejarla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Añadir el complejo de lípidos de ADN a los pozos correspondientes con las células en medio libre de suero. A continuación, mezcle suavemente la placa balanceándose hacia adelante y hacia atrás.
Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cuatro a seis horas. Después de la incubación, retirar el medio y reemplazarlo con dos mililitros de DMEM por pozo. Luego incubarlo durante otras 36 a 48 horas.
Semilla cada tipo de célula susceptible a 10.000 células por pozo y una placa de 96 pozos. A continuación, deje la placa durante la noche en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius y cinco por ciento por ciento. Al tercer día después de la transfección, compruebe el color del medio que debe ser de color rosa claro o ligeramente naranja y examine las células con un microscopio biológico florescente invertido bajo una longitud de onda de 440 a 460 nanómetros.
A las 38 a 48 horas después de la transfección, cosecha las partículas pseuotipadas o PPS pasándolas a través de un filtro de membrana de fluoruro de polivinilideno de 0,45 micrómetros para eliminar los desechos celulares, luego divídalas en alícuotas de pequeño volumen y guárdelas a menos 80 grados Celsius. Para cuantificar el PPS, transfiera 30 microlitros de las partículas virales purificadas a un tubo libre de gluquelador de 1,5 microlitros y añada un microlitro de Benzonase Nuclease. Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante una hora para eliminar cualquier contaminación por ADN y ARN.
Después de la incubación, congelar la muestra a menos 70 grados Celsius para activar la nucleasa y añadir dos microlitros de Proteinase K.Incubar la mezcla durante 30 minutos para digerir las proteínas de envolvente y liberar el ARN CMV-GFP. Luego inteítese la Proteinase K a 100 grados Celsius durante tres minutos. Cuantifique el PPS con la transcripción inversa cuantitativa RTPCR utilizando el kit RT-qPCR de una sonda universal de un paso en los primeros y sondas especificados en el manuscrito de texto.
Normalice el PPS a cuatro veces 10 a la quinta copia de ARN por mililitro. A continuación, agregue TPCK-trippsin a una concentración final de 10 microgramos por mililitro en el PPS que alberga H7N9 hemagglutinina. Incubar el PPS a 37 grados celsius durante una hora para formar las subunidades funcionales HA1 y HA2.
Mezclar el PPS normalizado con el medio DMEM en una proporción de uno a uno, luego llevar la placa que contiene células susceptibles al gabinete de bioseguridad. Aspirar el sobrenadante y lavar las células una vez con 100 microlitros de PBS precalentado. Añadir 100 microlitros de mezcla PPS-DMEM en cada pozo, triplicando las pruebas de infectividad de cada tipo de PPS a una línea celular susceptible.
Incubar la placa durante cuatro a seis horas a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. A continuación, aspirar el sobrenadante y reemplazarlo con 100 microlitros de DCM Incubar la placa durante otras 24 a 36 horas antes de la detección de la infectividad. Nuestros resultados son PPS se consideran ahora infecciosos para las personas.
Por lo tanto, se recomiendan los procedimientos de protección segura necesarios para tomar, como usar una máscara y realizar los ensayos de infectividad en un gabinete de bioseguridad. Este protocolo se generó para generar 10 tipos de partículas pseudotipo o PPS con dos hemaglutinina agrupadas y neuraminidasa del virus de la estomatitis vesicular G glicoproteína o sin glicoproteínas de envolvente. El PPS se grafió con microscopía electrónica de transmisión y su infectividad se evaluó en dos líneas celulares, A549 y MDCK.
En el grupo PPS que alberga H5, la infectividad de H5N1, H5 más N9 y H5 fue aproximadamente 90%18% y 10% para la línea celular A549 y 40%5% y 5% para MDCK, respectivamente. En el grupo PPS que alberga H7, la infectividad de H7N9, H7 más N1 y H7 fue aproximadamente 10%7% y 1%para la línea celular A549 y 8%4%y 1% para MDCK, respectivamente. La infectividad del virus de estomatitis vesicular G glicoproteína PP fue de aproximadamente 21%para A549 y 16%para las células MDCK.
Mientras que el PP de sobre delta no mostró infectividad. Es fundamental recordar que las células HEK-293T/17 del productor de PP constituyen la base de este procedimiento. Así que el crecimiento óptimo nos enseña células HEK-293T/17 es lo más importante.
Siguiendo este procedimiento o alguna otra prueba como L2 receptar el ensayo de límite se puede realizar. Este ensayo casi puede deshacerse de las peculiaridades biológicas de la preferencia del receptor y el patrón revelará el tropismo del PPS. Desde que tomaron las glicoproteínas del virus de la gripe se clonan en dos más máx.
HA y las proteínas NA se pueden estudiar por separado por lo que reasociamos entre ellas. Los mutantes y los efectos maduros se pueden explorar.
